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doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.11.816 文章編號：1004-7484（2013）-11-6794-02
顯微鏡是基層檢驗科工作中常用設備之一，是臨床診斷及生物學檢查的重要檢測器械，對疾病臨床診斷具有重要指導意義。本文將對2012年2月――2013年2月期間我院進行治療患者的新鮮晨尿80份作為研究對象，對比顯微鏡檢驗技術和全自動尿沉渣分析儀檢測結果，其宗旨為加強顯微鏡檢驗技術在基層檢驗科的應用提供數據依據，現將結果報道如下。
1 資料與方法
1.1 臨床資料 選擇2012年2月――2013年2月期間我院進行治療患者的80份新鮮晨尿（血尿）20ml作為研究對象，且均經腎臟病理檢查確診為腎小球血尿。
1.2 方法 對所采集的新鮮晨尿平均分為兩個試管，一試管采用UF-100全自動尿沉渣分析儀，并嚴格參照操作說明書進行檢驗，另一試管采用光學顯微鏡檢驗技術檢驗，具體操作如下：將標本采用離心機，以1500r/min速率離心5min后，去除上清液，取底部0.2ml帶沉淀的液體，將保留液充分搖勻后均勻涂片鏡檢，高倍鏡下將RBC和WBC分為20個視野進行觀察，以平均數為統計量，低倍鏡下對管型分為10個視野進行觀察，以平均數為統計量。雙人雙盲法計算平均值，尿液標本在收集后2h內檢測完畢。
1.3 觀察指標 觀察對比兩組檢驗方法對紅細胞形態檢驗結果及與腎臟病理的符合情況。
1.4 評價標準
1.4.1 UF-100全自動尿沉渣分析儀檢測 參考Hyodo提供的參考標準：①非腎小球性血尿，80%紅細胞前前向散光射強度（FSC）≤84ch，呈均一性紅細胞；②腎小球性血尿，FSC≤126ch且84ch，呈非均一性紅細胞；③混合性血尿，FSC介于兩者之間。
1.4.2 顯微鏡檢測 鏡下血尿為每高倍視野均可見≥3個紅細胞。①腎小球血尿，畸形紅細胞80%，呈非均一性紅細胞；③混合性血尿，介于兩者之間。
2 結 果
全自動尿沉渣分析儀和光學顯微鏡對80份血尿標本進行檢驗并與腎臟病理比較，其光學顯微鏡腎小球血尿檢出率為83.75%，明顯高于全自動尿沉渣分析儀的67.5%，兩種檢驗方法比較差異具有統計學意義，P
3 討 論
隨著醫療技術進步，先進檢驗設備逐漸應用于檢驗科，其自動化水平高，可簡化操作流程，降低檢驗污染率，快速有效為臨床提供檢出結果，但因受干擾物等因素的影響，可能會出現假性結果或漏檢，而應用光學顯微鏡檢查，因其觀察檢驗標本具有直觀、簡便、特異性好等優點，可顯著提高檢出率，具有較高臨床檢驗價值。
本文研究中，收集臨床數據資料作為加強顯微鏡檢驗技術在基層檢驗科應用的依據，分別采用全自動尿沉渣分析儀和光學顯微鏡對80份血尿標本進行檢驗并與腎臟病理比較，其光學顯微鏡腎小球血尿檢出率為83.75%，明顯高于全自動尿沉渣分析儀的67.5%，結果提示，全自動尿沉渣分析儀對血尿標本檢查起到篩查作用，而顯微鏡檢查相對來說才是“金標準”。盡管顯微鏡檢查操作繁瑣且操作要求較高，但臨床檢出率較高，為此臨床應加強顯微鏡檢驗技術在基層檢驗科的應用，進一步提高檢出率。
由此，本文將加強顯微鏡檢驗技術的臨床應用體會總結如下：①加強對顯微鏡技術的重視，基礎檢驗科檢驗人員應正確認識顯微鏡技術在臨床診斷中的積極臨床意義，由于顯微鏡下形態學涉及血液、體液、微生物學及免疫學，為此工作人員應熟悉掌握檢驗醫學各個亞專業及特點，如對高菌群失調引起的腹瀉診斷中，顯微鏡下直接涂片后即可做出初步診斷，并將分泌物進行培養檢驗，即可發現致病菌株，對臨床針對性用藥具有重要臨床價值；②摒棄對顯微鏡檢驗消耗時間、人力、精力的錯誤觀點，使其認識到顯微鏡檢測陽性細菌結果明顯并其他先進儀器檢測更為準確等優點，定期開展顯微鏡臨床應用知識培訓，正確引導使用顯微鏡的技巧，積累工作經驗，以此加強檢驗工作人員的業務能力及檢驗技能，并提高顯微鏡檢驗準確率；③醫院及檢驗科領導加強對檢驗科質量監督，要求檢驗人員嚴格遵守顯微鏡檢測流程，對全自動尿沉渣分析儀等先進儀器檢驗后，再應用顯微鏡技術復查，確保檢驗結果準確性，為臨床診斷及治療提供理論支持。
綜上所述，顯微鏡檢驗技術是基層檢驗科不可缺少的重要檢驗工作環節，積極加強顯微鏡檢驗技術的應用，促進科學、規范化顯微鏡檢驗，對提升醫學形態學檢驗水平有重要的臨床價值。
參考文獻
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光波的限制
早在公元前1世紀，人們就已經發現了這么一個現象：通過球形透明物體去觀察微小的物體時，可以使其放大成像。1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經造出類似顯微鏡的放大儀器。1665年前后，英國生物學家胡克發明了類似現在學校實驗室里用的顯微鏡，并通過這臺顯微鏡看到了軟木中網格狀的結構，胡克稱之為細胞。這是人類歷史上最偉大的發現之一，大大推動了生物學的發展。
自從顯微鏡發明以來，科學家就不斷對它進行改進，期待獲得更大的放大倍數和更高的分辨精度。1873年，德國顯微鏡學家恩斯特?阿貝通過計算發現，由于光波相互干擾的原因，光學顯微鏡不能無限度地放大微小物質，最多只能“看到”光波波長一半的物質，即尺寸不小于200納米的物質。這就是有名的“阿貝原則”，200納米也被稱為光學顯微鏡的“繞射極限”。
“阿貝原則”公布之后，科學家感到十分沮喪，因為分子和原子的尺寸大多在200納米以下。也就是說，光學顯微鏡似乎難以“看到”分子和原子所活動的納米世界了。打個比方來說，如果生命是一座城市，那么細胞就是城市中的每一個房間。我們肉眼只能看到生命“城市”和器官、組織等“建筑”，光學顯微鏡只能看到細胞“房間”，卻難以看到“房間”內的物品。
因此，科學家開始發明多種能“看清”納米世界的電子顯微鏡。這些顯微鏡居然可以看到最小尺寸為0.2納米的原子，是光學顯微鏡精度的1 000倍！
讓分子發光
正當電子顯微鏡大展身手的時候，分子生物學家很快發現了一個問題：在物理學和化學研究中得心應手的電子顯微鏡，到了分子生物學研究中往往有些“水土不服”。因為電子顯微鏡不能研究活物，它們必須把細胞“殘忍地殺死”后才能進行觀察。這樣一來，生物學家就難以研究分子在活細胞中的正常活動。
于是，生物學家就得重新考慮如何研制出精度超越200納米的光學顯微鏡。顯然，按照傳統的方法繼續研究，那就是“鉆牛角尖”了，到了必須換種思路來突破“繞射極限”。這種新思路還真被科學家想到了，那就是不再用外來的光源觀察細胞，而是讓細胞中的分子發出熒光來觀察它們。因此，目前生物學家所用的超分辨率顯微鏡也叫熒光顯微鏡。
如何讓細胞中的分子發出熒光呢？赫爾發明了熒光手電來解決這個問題。赫爾先利用成熟的分子染色技術給細胞注射熒光物質，熒光物質像染料一樣沾染到細胞中的生物大分子上。然后，利用熒光手電發出極細的激光束照射生物大分子，大分子上的熒光物質被激發而發出熒光，就像是生物大分子本身發光一樣。
突破極限
為何發出熒光的細胞就可以讓光學顯微鏡突破極限呢？因為在周圍環境黑暗的情況下，顯微鏡就可以看到細胞中發光的分子。有一個很好的例子可以說明這個問題。在明亮的白天，我們很難看到幾百米外的一盞燈泡；如果是在漆黑的夜晚，這盞燈泡亮起來之后，我們就可以看到它了。
如果夜晚遠處只有一盞燈，我們可以很好地分辨出這盞燈。如果夜晚遠處有一大片燈，甚至有一座明亮的城市，我們就很難分辨其中的一盞燈，這是因為光線相互干擾，“阿貝原則”又起作用了。因此，赫爾得想辦法消除光線干擾。他改進熒光手電，讓它可以發出一束激光讓生物分子發光，再用另一束激光消除其他熒光，通過兩束激光交替掃描細胞，就可以“看清”生物中的大分子了。
莫爾納爾和白茲格進一步想出了一些辦法，消除或濾掉細胞中多余的熒光，結果讓顯微鏡居然成功地“看到”單個的生物分子，這被稱為單分子熒光顯微鏡。
活生生的納米世界
諾貝爾化學獎評委會認為：“理論上講，如今沒有什么物質結構小得無法研究?！痹陔娮语@微鏡時代，納米世界就像沙漠一樣一片死寂，其中的所有物質都靜靜地躺在那里。然而，超分辨率光學顯微鏡讓我們可以看到活生生的納米世界，所有的生物分子按照它們原本的“生活方式”繼續活動，就像顯微鏡、熒光染料、激光這些東西不存在一樣。
有了超分辨光學顯微鏡，科學家就可以從分子層面看到生命生老病死所帶來的變化，為研究疾病機理和開發藥物提供了一個新的視野。我們將是這些成果的最大受益者，因為這些成果可以更好地維護我們的健康。
中圖分類號： O43 文獻標識碼： A 文章編號：
隨著更小、更快、更高度集成的光學和電子設備的需求日益增加，存在許多具有挑戰性的問題，在制造光學零件，例如，大尺寸，高數值孔徑，大型非球面零件，對表面粗糙度、表面結構等要嚴格控制制造公差。三維測量不僅保證了光學產品的質量，也為制造過程的監測/控制提供了保障，是一項實用的技術。
1、微/納米結構的三維測量
有多種技術可用于測量微/納米結構，包括成像方法和非成象方法。每種方法都有其優點一方面，但也有缺點在另一方面。光學顯微鏡作為最經典的方法，具有快速和容易使用的特點。其中有些是可以執行具有高垂直分辨率的三維測量。然而，由于光的衍射性質，光學顯微鏡的橫向分辨率也是有限的。使用高孔徑物鏡和光源更短的波長是一種有效的方式，以提高其橫向分辨率。掃描電子顯微鏡具有很高的分辨率，在下降到1.5時，使用的電子能量小于1千電子伏。但是，它必須在真空中進行，也缺乏三維測量能力，有時還具有破壞性。電子光學測量系統由低電壓的掃描電子顯微鏡中一個大的真空室和一個300毫米x-y定位階段控制的真空激光干涉建立起來的，早在1998年就已經出現。散射測量能夠快速用于直接測量，但是，它需要先進的數學建模工具和數據評估系統，以解決其存在的問題，其中的幾何形狀的三維結構是必備的知識。系統的概念是可變的和通用的，所以，可以執行許多不同類型的測量，例如，經典的散射儀，橢偏散射儀等。掃描探針顯微鏡技術允許直接測量三維形狀的納米結構，既具有高的橫向和垂直分辨率，也不具有非破壞性。
1.1計量大范圍顯微鏡
SPM通常有一個小的掃描范圍內，一般為幾十微米。這一方面極大地限制了其進一步的應用。為了延長測量量，以及提高校準能力，計量大范圍原子力顯微鏡的出現使測量體積達到25mm×25mm×5mm。將待測量的樣品沿z軸方向放置在2μm的z壓電階段。z壓電階段的延伸是由嵌入的電容式傳感器具有亞納米分辨率進行測量的。機械地安裝在一個三維（3D）機械定位階段的運動平臺的z壓電階段，簡稱為納米測量機。NMM的運動平臺包括三個高精度的彼此正交的平面鏡和一個反射鏡角。三個嵌入式零差干涉儀是用來測量運動平臺的位置相計量幀的，分辨率為0.08 nm。自制一種新的原子力顯微鏡頭，被機械的固定在微晶玻璃柱上。三個干涉儀的測量光束的交點處位于懸臂尖端位置。在這種方式，測量原理得到滿足。在NMM的z壓電階段的詳細描述中也介紹了其他方面。
1.2層厚度的測量
涂層是一個重要的光學部件的制造過程。光層的厚度和均勻性，需要精確地測量/控制中。有多種技術可用于層厚度的測量，包括光學顯微鏡，反射計和橢圓儀。其中，橢偏儀的主要應用的方法之一是能夠表征薄膜厚度的單層或復雜的多層。它可以實現極高的測量穩定性。然而，它的測量不確定度大，對系統會產生一定的誤差，因此該儀器的校準是一個關鍵問題。
1.3側壁結構的測量
光學結構的側壁特性，可能會影響光學部件的性能。例如，在光波導和菲涅爾透鏡，大型側壁的粗糙度將導致高光散射造成的損失。側壁結構的測量是比較困難的。盡管目前由多種顯微技術弧測量微納米結構，但是幾乎所有的技術在側壁測量時都會遇到問題。如圖1示例，原子力顯微鏡（AFM）和觸針的探針通常有一個尖與錐體或圓錐形狀，在圖1（a）中，觸針永遠不會靠近側壁。在光學顯微鏡和電子顯微鏡下，圖7（b）中由于在側壁或側壁之間存在多重反射的反射差導致測量比較困難。在以往，通常采用破壞性切割來測量結構的側壁。
（a）原子顯微鏡和輪廓儀（b）光學顯微鏡和電子顯微鏡
圖1 傳統測量技術在測量側壁中的遇到的問題
1.4未來納米結構的三維測量
雖然大多數原子力顯微鏡結構提供完美的3D視圖，但它們不是真正的3D測量儀器，這是由多種因素引起的。首先，幾乎所有的原子力顯微鏡探針具有圓錐形或錐體形狀，具有陡峭的側壁，這是不能夠測量三維形狀的結構，如圖1（a）所示。其次，正常的原子力顯微鏡適用于沿z軸的伺服回路保持的前端樣品相互作用常數。在測量時可能會遇到困難，例如，垂直結構。第三，正常的原子力顯微鏡測量表面像素平等的橫向距離。
2、形狀計量
光學部件的形狀誤差的對光學系統的性能有著顯著的影響作用。由于對光學系統對性能要求非常高，也使得光學部件的幾何量計量變得越來越有難度。例如，在先進的光刻機或同步反射鏡透鏡的制造中，制造公差變低，甚至下降到納米級。在這些光學制造過程中，越來越多的是減少光學像差和減少光學元件的數量，而不是球面透鏡的非球面鏡片強度。
在多種可計量形式中，光學干涉是最常用的計量方法之一。在它的配置中，從測量表面反射的波陣面與從參考反射鏡反射的波陣面進行干涉。波陣面的差異也就是參考和測量表面的形式之間的差異，通過內插的干涉條紋可確定。邁克爾遜干涉儀或菲佐型強麥都比較適用。光學干涉有諸多的優點，如可以結合而為城鄉對測量速度進行提高，不確定性低，操作簡單等。采用2D光學干涉測量非球面結構時，如直接采用計算機產生全息圖的剖面是，是一種廣泛使用的儀器，用于測量光學零件的輪廓和形式。許多不同種類的傳感器，包括非接觸式光學傳感器和手寫筆傳感器與干涉輪廓儀相比更加靈活，能夠適用與不同形式的測量。
3、結束語
三維測量技術在實際應用過程中不僅保證了光學產品的質量，也為相關制造過程提供的監測/控制依據。本文介紹了一些三維測量的研究，以支持光學制造。計量大范圍原子力顯微鏡，真正的3D原子力顯微鏡適用于多功能三維測量微/納米結構。
參考文獻
目的：利用激光共聚焦顯微鏡評價超聲乳化白內障摘除術后角膜的活體組織學改變。方法：隨機選擇中國醫科大學眼科醫院30例欲行白內障摘除手術的患者進行超聲乳化白內障摘除術?；颊哂谑中g前、術后1，7，30d；6mo，利用海德堡Retina Tomograph IIIRostock Cornea Module (HRTIII RCM)激光共聚焦顯微鏡對角膜各層細胞及神經進行形態學分析。結果：形態學觀察發現角膜上皮細胞和前基質細胞在術后無明顯改變。角膜基質神經纖維呈不規則的節段狀改變，在術后第7d最為顯著。中基質及后基質層的角膜細胞同術前相比反射更為明顯。角膜內皮細胞的細胞核和細胞質腫脹。結論：超聲乳化白內障摘除手術對角膜組織有一定的影響，導致細胞和組織形態的改變，但這些改變是可逆的。
【關鍵詞】 超聲乳化白內障手術；角膜；組織學
Abstract AIM:To define the microscopic cornea changes with in vivo laser scanning confocal microscopy after phacoemulsification.METHODS: Thirty eyes were assigned to undergo cataract extraction by ultrasonic phacoemulsification in China Medical University. The morphologies of corneal layer by layer were evaluated in vivo with the Heidelberg Retina Tomograph IIIRostock Cornea Module (HRTIII RCM) confocal microscope pre and postoperation for up to six months.RESULTS: For morphology， some irregular segments of nerve fiber were most pronounced seven days postoperation. Stroma keratocytes were obvious compared with the preoperative condition. Corneal endothelial cells become obviously swollen in both the cytoplasm and nucleus. At six months， corneal cell and nerve morphology recovered to normal.CONCLUSION: Microstructural abnormalities were identified at each level of the cornea recovery process after phacoemulsification and lead to corneal morphology changes， but these could be recovered to normal in six months.
KEYWORDS: phacoemulsification; cornea; histology
0 引言
超聲乳化白內障吸除術最主要的優點是減小手術切口、減輕組織損傷、使患者視力更快恢復。現代白內障手術技術的進步將手術引起的散光和炎癥降到最低，術后視力恢復快［1］。而角膜水腫成為影響術后視力恢復的主要因素。在過去圍繞術后角膜并發癥的研究多集中在角膜內皮失代償和觀察內皮細胞改變上（例如細胞數、密度和/或形態）［24］。目前還沒有活體角膜各層組織改變的觀察。新一代海德堡激光共焦顯微鏡的角膜模塊，可以提供高分辨率的眼表組織圖像，使我們能夠活體動態觀察角膜組織改變和角膜界面的形態［5］，分析超聲乳化白內障吸除術后角膜組織的改變。我們利用該設備觀察超聲乳化白內障摘除術后6mo內角膜的組織學改變，包括：角膜上皮細胞、角膜上皮下神經纖維、角膜基質神經纖維束、角膜基質細胞、角膜內皮細胞等。
1 對象和方法
1.1 對象
我們隨機選取200609/200704我院行年齡相關性白內障吸除術的患者25例30眼，男13例，女12例，平均年齡57.8（52±6.7）歲。納入標準：散瞳后瞳孔≥7mm，圖1 A：術前角膜上皮細胞為大小不一的多角形細胞鑲嵌在一起，部分細胞可見細胞核；B：術后第1d部分患者出現片狀的翼狀細胞邊界消失；C：術前角膜神經纖維；D：術后第7d神經纖維呈不規則的節段狀；E：正常角膜前彈力層的朗格漢斯細胞；F：手術后朗格漢斯細胞形態沒有變化；G：術前基質層的神經纖維；H：術后1mo兩例患者出現基質神經不規則彎曲和串珠狀改變。
角膜內皮細胞計數＞2000 個/mm2。排除標準：患有眼部其他疾病或影響角膜恢復的全身疾患，如：角膜病變、青光眼、葡萄膜炎、干眼或有內眼手術史、系統疾病如：糖尿病。
1.2 方法
常規術前檢查，包括視力檢查，雙眼裸眼遠近視力(UCVA)和最佳矯正遠近視力(BCVA)；裂隙燈顯微鏡檢查角膜、前房、晶狀體混濁程度；眼底檢查；眼壓；角膜內皮細胞檢查；B超；屈光狀態(自動驗光儀等)及生物學測量(A超、IOL Master等)測量眼軸長度等。全部手術由同一位有經驗的術者進行。使用Infiniti超聲乳化儀(Alcon， USA)，全部患者術前接受5g/L鹽酸丙美卡因滴眼液(Alcaine， Alcon， USA)表面麻醉，3.0mm透明角膜切口，3g/L透明質酸鈉與40g/L硫酸軟骨素(Viscoat)（Alcon， USA）保護角膜內皮。行5.5～6.0mm連續環形撕囊，白內障超聲乳化吸除，負壓500mmHg、流量35mL/min，瓶高95cm。囊內植入Acrysof SN60AT或SA60AT人工晶狀體(Alcon， USA)，I/A吸除黏彈劑。術后自第1d起給予典必殊滴眼液3次/眼，療程4wk，全部患者無術中或術后并發癥。利用最新的HRT Ⅲ/RCM共焦顯微鏡檢查全部患者，HRT Ⅲ縱向分辨率約1μm，可以實現活體角膜各層的圖2 A：角膜基質；B：術后1mo內，前基質層細胞形態未見明顯變化；C：術前的中基質層細胞；D：手術后角膜中基質細胞形態無明顯改變；E：手術前后層基質細胞；F：手術后后基質細胞層細胞反射明顯且細胞明顯腫脹；G：角膜內皮細胞；H：術后1mo的角膜內皮細胞數明顯下降，細胞明顯腫脹，失去六角形外形而變得不規則，細胞核清晰可見。
研究［5，6］。HRT Ⅲ/RCM的激光光源使用波長670nm的二極管激光。進行活體共焦顯微鏡檢查前，于結膜囊下穹窿部滴1滴5g/L鹽酸丙美卡因滴眼液和1滴凝膠型人工淚液2g/L卡波姆（Bausch & Lomb， US）。檢查在矢狀軸進行，因此檢查時，能夠精確顯示角膜各層結構。對全部患者進行中央角膜各層采集，每個患者在同一檢查層面至少采集5張共焦顯微鏡圖片。每眼的檢查時間
2 結果
2.1 角膜上皮
術后1mo中央角膜上皮形態無明顯改變。術前角膜上皮細胞為大小不一的多角形細胞鑲嵌在一起，部分細胞可見細胞核（圖1A）。有8例在術后第1d出現片狀的翼狀細胞邊界消失（圖1B），在第3d恢復。
2.2 角膜神經纖維
角膜神經纖維位于前彈力層和基底上皮細胞之間。術前可見角膜神經呈清晰的、反射均一的線狀結構。局部還觀察到一些樹枝狀或細小神經纖維束(圖1C)。手術后神經纖維呈不規則的節段狀，于術后第7d最明顯(圖1D)。部分神經纖維出現異常分支，斷續排列，主干神經纖維增粗、彎曲，反射強弱不均。術后30d尚未恢復，于術后6mo形態恢復正常。
2.3 前彈力層和朗格漢斯細胞
在正常角膜，前彈力層為無定形的均一的間質層。Patel和McGhee研究發現出現于前彈力層的細胞稱為朗格漢斯細胞［6］。本研究觀察到手術前朗格漢斯細胞表現為亮的細胞微粒和無突起的細胞體，或細胞樹突（圖1E）。手術后細胞形態沒有變化（圖1F）。
2.4 角膜基質層的神經纖維
基質層的神經纖維位于前部和中間基質層之間。術前基質層的神經纖維為粗的、高反射、直線性結構（圖1G）。術后1mo，有兩例患者出現基質神經不規則彎曲和串珠狀改變（圖1H）。
2.5 角膜基質
前基質細胞界限清晰、高反射、細胞核呈卵圓形，位于不同位置 （圖2A）。在術后1mo內，前基質層細胞形態未見明顯變化（圖2B）。中基質層細胞為規則的橢圓形，較前基質層細胞密度低（圖2C）。手術后角膜中基質細胞形態無明顯改變，但細胞較術前反射高（圖2D）。手術前，后層基質細胞較前基質層細胞圓（圖2E），手術后，后基質細胞層細胞反射明顯，且細胞明顯腫脹（圖2F），至術后6mo恢復。
2.6 角膜內皮細胞
術前角膜內皮細胞呈規則排列的六角形細胞，細胞體高反射、細胞邊界低反射，細胞核不明顯（圖2G）。術后角膜內皮細胞數明顯下降，細胞明顯腫脹，失去六角形外形而變得不規則，細胞核清晰可見，至術后1mo未恢復（圖2H），手術后6mo細胞形態恢復正常，但仍然可見細胞核。
3 討論
與白內障囊外摘除手術（ECCE）相比，超聲乳化白內障吸除術最主要的優點是減輕組織損傷、使視力更快恢復，但是仍然存在術后并發癥。研究表明白內障手術后內皮細胞數降低和術后角膜水腫與超聲乳化白內障吸除術后角膜內皮細胞的丟失有著密切的關系［7］。目前對術后角膜并發癥的研究集中在角膜內皮細胞丟失和角膜厚度方面，其檢測設備有角膜厚度測量儀、非接觸式角膜內皮鏡等，但觀察活體角膜各層修復過程的檢查方法十分有限。最近活體激光共焦顯微鏡開始在實驗室和臨床應用。它可以實現對角膜顯微結構更詳細的逐層觀察，能夠提供眼表的高分辨率圖像，以供觀察角膜組織的改變。
我們利用活體激光共聚焦顯微鏡觀察了超聲乳化白內障吸除術后角膜各層的改變。至術后1mo，大部分病例與術前比較，中央角膜上皮細胞的形態無明顯變化。部分病例表現為術后第1d翼狀細胞邊界不清，3d后恢復。在角膜神經方面，我們觀察到一些纖維節段不規則增粗。與術前比較，一些神經纖維出現中斷、更加迂曲等改變。角膜基質層可以觀察到術后角膜基質細胞水腫和細胞密度降低，這種現象多出現于角膜后基質層。對于角膜內皮細胞，與術前比較出現顯著的內皮細胞密度減低，且有統計學意義。術后內皮細胞及細胞核水腫明顯，至術后6mo細胞形態才恢復正常。以上各層角膜組織的形態改變在術后6mo的復查中均恢復了正常。
根據對術后角膜情況的觀察，我們將白內障手術中可能影響角膜的因素歸納為以下4類：（1）對角膜內皮的直接機械損傷包括：切口和手術過程中晶狀體碎屑、器械或人工晶狀體（IOL）接觸角膜；（2）灌注液的影響（化學成分、流速、湍流、滲透壓）［810］；（3）超聲乳化能夠在前房產生羥基，引起組織損傷；（4）針頭在切口內前后運動，金屬針頭振蕩壓迫袖套，使溫度升高引起熱損傷。
盡管超聲乳化白內障摘除術后利用激光共聚焦顯微鏡可以觀察到角膜組織在顯微結構上存在一定的異常改變，但這些損傷在術后很快就能恢復。將來對于各層細胞還應進一步進行定量分析，以指導臨床醫生對白內障術后角膜恢復過程的全面了解。
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與傳統尿紅細胞檢測方法相比， HT-2000尿沉渣分析儀具有檢測速度快、精密度高以及重復性好等顯著優勢， 能夠有效緩解因工作人員短缺而無菌尿液標本數量大所帶來的工作壓力， 解決了尿沉渣分析無法標準化的重大難題 。均一性與非均一性尿紅細胞檢測能夠對腎性與非腎性血尿診斷產生重要的影響 。本次研究收集2014年5月～2015年5月送檢住院患者的無菌尿液3000份， 使用HT-2000尿沉渣分析儀檢測尿紅細胞時結合光學顯微鏡進行檢測， 有效提高了檢測準確性， 現報告如下。
1 資料與方法
1. 1 一般資料 選取遼寧省義縣人民醫院2014年5月～ 2015年5月送檢住院患者的無菌尿液3000份， 標本于采集后2 h內完成。儀器與試劑：HT-2000尿沉渣分析儀、質控品與配套試劑， 普通光學顯微鏡， 刻度離心管與水平離心機。
1. 2 方法 將收集到的無菌尿液樣本進行混合， 攪勻后分裝入兩支管中， 每管各10 ml， 采用雙盲法進行操作。其中一管采用HT-2000尿沉渣分析儀進行檢測， 另一管首先1500 r/min， 離心5 min， 再棄掉上清液， 沉渣后使用光學顯微鏡進行檢測， 2 h內完成檢測。
1. 3 判斷標準 HT-2000尿沉渣分析儀標準：紅細胞每微升>24個， 則為檢出陽性。光學顯微鏡標準：每高倍視野紅細胞>3個， 反之則是陰性結果， 對兩種方法的紅細胞陽性率與HT-2000尿沉渣分析儀檢測紅細胞的假陽性率進行計算。
2 結果
3000份無菌尿液標本中， HT-2000尿沉渣分析儀檢測結果顯示陽性663例， 陽性率為22.1%；光學顯微鏡檢測結果顯示沉渣分析儀無漏診， 僅有誤診， 陽性524例， 假陽性139例， 陽性率為17.5%， 假陽性率為5.6%。139例假陽性無菌尿液樣本中， 有酵母菌11例， 占7.9%， 有細菌56例， 占40.3%， 結晶68例， 占48.9%， 其他因素4例， 占2.9%。見表1。
3 討論
尿沉渣就是尿液中的有形狀成分， 是原尿經過離心后， 形成的沉渣， 是尿液有形成分質和量的組合， 包括細胞、管形、結晶、細菌、等各種有形成分， 因此， 尿沉淀檢測可以準確判定泌尿系統疾病的具體發病部位， 還可以實現對疾病診斷、鑒別診斷與預后的判斷。此外， 應注意的是患者采尿后應該迅速地進行檢測， 否則放置時間過長， 如果是低張尿可出現溶血；如果是高張尿有可能出現脫水而使紅細胞形狀發生變化；如果是堿性尿可使血細胞成分和管型崩壞， 影響檢驗的準確性 。
尿沉淀檢測可以發現實驗室檢查過程中難以檢測到的異常情況[1-3]。因為尿沉淀檢測有著非常高的準確性， 所以在臨床中規范尿沉淀檢測的操作與檢測是十分必要的。尿沉淀檢測中最為重要的指標是尿紅細胞：在腎臟病診斷、病情發展以及預后判斷中， 尿紅細胞檢測有著非常重要的意義， 對紅細胞進行定量分析是對其臨床意義進行研究的關鍵所在[4-6]。HT-2000尿沉渣分析儀對紅細胞進行檢測， 結果顯示假陽性比較少， 在用于標本量較大的實驗室中時能夠有效提升工作效率。
當前， 尿沉淀分析檢測采用的主要方法有干化學法、顯微鏡檢測法以及流式尿液檢測法等。HT-2000尿沉渣分析儀在檢測不同項目采用不同的雙波長測定試紙塊顏色變化， 以鑒別尿液樣本中的有形成分。因為HT-2000尿沉渣分析儀具有圖形直觀、操作簡便、結果值穩定以及檢測速度快等特點， 所以在臨床中的應用非常廣泛。
HT-2000尿沉渣分析儀的主要工作機理是采用冷光源積分球檢測技術， 報告結晶、上皮細胞、細菌、紅細胞與白細胞等有形成分。但是尿液中的有形成分較為相似， 且尿液中成分非常復雜， 各項檢測指標與檢測項目中因染色、雜質等因素有存在一定相似性。此外HT-2000尿沉渣分析儀在檢測過程中會受到一定限制， 從而使檢測結果有一定的偏差。比如UF-100尿沉渣分析儀就無法有效識別藥物結晶成分、脂肪滴以及腫瘤細胞等物質， 同時也無法識別紅細胞的病理類型及形態[7， 8]。所以， 如果患者尿液中存有大量細菌成分或結晶成分時， 會影響到紅細胞的測定， 導致假陽性結果的發生， 進而影響到患者疾病的診斷。
本次研究收集2014年5月～2015年5月送檢住院患者的無菌尿液3000份， HT-2000尿沉渣分析儀檢測結果顯示陽性663例， 陽性率為22.1%；光學顯微鏡檢測結果顯示沉渣分析儀無漏診， 僅有誤診， 陽性524例， 假陽性139例， 陽性率為17.5%， 假陽性率為5.6%。139例假陽性無菌尿液樣本中， 有酵母菌11例， 占7.9%， 有細菌56例， 占40.3%， 結晶68例， 占48.9%， 其他因素4例， 占2.9%。對HT-2000尿沉渣分析儀檢測紅細胞顯示為陽性， 需要再接受鏡檢復查， 避免發生臨床誤診。諸多學者與專家也曾建議， 對尿液進行分析時， 最好采用干化學法聯合尿沉渣自動分析儀共同進行篩查， 并對尿沉渣全自動分析儀提示類酵母菌、項目結晶、病例管型陽性以及細菌計數過高的標本和腎病患者的標本， 同時結合顯微鏡檢測， 能夠有效提升尿液標本的檢驗質量 。
綜上所述， 使用HT-2000尿沉渣分析儀檢測尿紅細胞時結合光學顯微鏡進行檢測， 能夠有效提高檢測的準確性， 值得在臨床中進一步推廣應用。
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1.1金剛石自支撐膜的制備本實驗采用自制的30kW直流電弧等離子體噴射設備。襯底為直徑65mm的鉬片，沉積前先用金剛石粉對鉬片表面進行研磨處理提高形核密度，然后用酒精超聲清洗。沉積條件為：Ar/H2/C3H8混合氣體,其中C3H8的體積分數1%，輸入功率17kW，反應壓力4.5kPa，沉積時間62h，薄膜沉積厚度700μm~800μm。采用機械方法對金剛石薄膜形核面和生長面進行雙面拋光，拋光后薄膜厚度在450μm左右，薄膜表面粗糙度Ra＜30nm。
1.2金剛石薄膜“黑色組織”表征
利用光學顯微鏡對拋光前后的膜進行透射光、反射光以及側入射光模式的觀察，利用X射線光電子能譜（XPS）和拉曼光譜（Raman）對黑色組織成分進行表征。
2結果與討論
圖1是樣品拋光前后的光學顯微鏡對比圖。圖A、B是拋光前在高倍光學顯微鏡下觀察某特定晶粒的顯微圖，由于生長面晶粒尺寸較大，光學顯微鏡景深很小，所以光學顯微鏡視場下除了焦平面，其余視場成像模糊。A圖是反射光成像，中間最明亮的大三角形即為（111）結晶面。晶面表面不是完全平滑的，有很多缺陷，中間表面“斷裂”部分尤其明顯。在反射光下，“斷裂”部分表現為黑色的粗線，其余表面相對平滑，反射光下黑色區域不明顯。當采用透射光時，（111）結晶面除原反射光下顯示的黑色區域外，黑色區域面積增大了。該區域邊緣模糊，深淺不一，占了晶面的大部分區域，但是這些黑色區域的范圍都在（111）晶面的晶界內部，這些增加的黑影即為晶粒內部“黑色缺陷”在晶粒表面形成的投影，“黑色缺陷”降低了薄膜的光學透過率。陷主要有兩種顯示形式：一種為團絮狀黑斑。這種團絮狀黑斑在視場中有兩塊，且它們集中分布區域的形狀與晶粒輪廓大致吻合，對比圖B，可以推斷圖中上下兩個大黑斑處于兩個大晶粒內部，這兩個晶粒中的黑色缺陷明顯多于其他區域。很多文獻報道[9~11]，（111）面容易出現位錯、孿晶等缺陷，這和圖1中我們的觀察結果一致。而且在拋光的過程中，（111）面很容易出現一些凹坑，這也說明（111）面存在一些缺陷導致晶粒在拋光過程中會出現“局部破碎”現象。這些證據都表明晶粒內部的一些缺陷影響了光的透射，形成了黑色缺陷，從而降低了金剛石膜的光學性能。
目的：探討利用熒光顯微技術對黎族藥物大青進行顯微鑒別的可行性，并為建立大青藥物質量標準提供科學依據。方法：利用研究級正置熒光顯微鏡對未經試劑處理的大青莖粉末和新鮮葉片進行觀察，并拍照。結果：大青莖粉末中主要含有3種類型的纖維，還含有木栓細胞、網狀導管、方晶、腺毛和非腺毛、鐘乳體，且圖像清晰。更特別的是在表皮細胞中還含有銅錢狀的物質及一圈熒光存在于皮層中。在葉片下表皮中氣孔數較多，角質層細胞波紋狀、還有鐘乳體、2細胞的腺毛、非腺毛等結構。結論：利用熒光顯微鏡鑒別生藥粉末，操作簡便，圖像直觀，值得開發利用。在葉片鑒別方面角質層、腺毛等結構清晰可辯，可代替掃描電子顯微鏡，但是還需結合普通光學顯微鏡來確定氣孔的類型。
【關鍵詞】 熒光顯微鏡；大青；黎族藥物；顯微鑒定
［ABSTRACT］ Objective: To explore the feasibility of fluorescence microscopic technique in the identification of Clerodendrum cyrtophyllum used in Li medicine and to collect scientific evidence for the development of its quality standards. Methods： The stem powder without reagent and fresh leaves of Clerodendrum cyrtophyllum were observed and photographed under fluorescent microscopy. Results：Under fluorescent microscopy， it was clearly shown that stem powder of Clerodendrum cyrtophyllum was mainly consisted of 3 types of fiber， cork cells， mesh tube， square crystal， glandular， non glandular and cystolith. More specifically， there were coinlike substances in the epidermis， a fluorescent ring in the cortex. Many stomata in the lower epidermis with ripplelike cuticle cells， cystolith， 2 cells glandular hairs， nonglandular hairs were shown in the fresh leaves images. Conclusions：It is feasible to use fluorescence microscopic technique in the identification of stem powder of Clerodendrum cyrtophyllum and the cuticle cells and glandular hairs in fresh leaves， but light microscope is also needed for the identification of stomata types.
［KEY WORDS］ Fluorescence microscopy; Clerodendrum cyrtophyllum; Li medicine; Microscopic identification
黎族藥物大青來源于馬鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.， 其根、莖、葉入藥，夏秋季采收，洗凈，鮮用。長期以來在華南地區常代替板藍根使用［1-3］。其黎藥名為雅楓能，莖葉入藥，具有清熱解毒的功效［4］。前人已對其根、莖的橫切片顯微結構進行了研究，但是對莖粉末結構的研究未見報道，在葉結構方面，也未見有研究報道［5］。另外，以往研究均利用普通光學顯微鏡，均需用試劑處理，才能觀察，并需一定的繪圖機能。在熒光技術方面，以往的熒光分析技術需將有效成分用試劑提取后才能在熒光分光光度計下測量其熒光光譜［6，7］，操作較麻煩。在葉片研究方面有報道認為利用熒光顯微鏡可觀察氣孔形狀，但不知對葉片其他結構形態是否有效［8］，因此，在本研究中通過嘗試對未經試劑處理的生藥粉末和新鮮葉片在熒光顯微鏡下，進行觀察，以探討利用熒光顯微技術進行生藥顯微鑒定的可行性，為開拓一種簡便有效的顯微鑒定方法，同時為黎族藥物大青質量標準的建立及開發黎藥提供科學依據。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
馬鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.， 從海南醫學院黎族藥用植物觀賞園采集，將其莖去掉葉片后曬干粉碎，取其粉末作為試驗材料。另外在實驗前夕取成熟大青葉片一塊，沖洗干凈晾干備用。所用儀器為研究級正置熒光顯微鏡（Olympus BX51）。
1.2 方法
在研究級正置熒光顯微鏡（Olympus BX51）的自然光下找到大青莖粉末觀察目標，再關上光柵，在熒光下觀察，并拍照。從備用大青葉片中間剪取2mm×2mm的葉塊，背面朝上置于載玻片蓋上蓋玻片后，同樣先在自然光下找到觀察目標，再關上光柵，在熒光下觀察，并拍照。
2 結果
2.1 大青莖粉末觀察結果
粉末淡黃色，含有的纖維主要有3種，即X形，L形和分叉狀等纖維（圖1A～C），木栓細胞表面觀四邊形，排列較整齊（圖1D），晶鞘纖維含量豐富，里面同樣含有很多數量的方晶（圖1E）。導管多破碎，多為網紋導管（圖1F～G），在粉末中含有鐘乳體、石細胞（圖1H～I），在木部薄壁細胞可看到一圈綠色的熒光，很快消失。在粉末中含有一定數量的非腺毛和腺毛（圖1J～K），值得注意的是在表皮細胞中還有許多銅錢狀的分泌組織（圖1L）。
2.2 大青新鮮葉觀察結果
大青葉下表皮淺綠色，在熒光顯微鏡下其角質層細胞垂周壁波狀或深波狀彎曲（圖1M），在葉表皮中可以看到存在鐘乳體（圖1N），單位面積上氣孔數量較多，同時也存在較多2細胞的腺毛，及少量非腺毛（圖1O）。
3 討論
3.1 大青莖粉末結構與大青莖橫切片結構比較
據文獻報道［3］， 大青莖（徑約5mm）之橫切面，最外緣表皮細胞，散見非腺毛；皮層韌皮纖維與石細胞，多個連生，排列成環，強木化，形成層，2～3層，細胞小，呈類長方形或扁長方形。木質部，由導管、木部薄壁細胞、髓線所組成，導管單個或2～4個連生，主要為網紋導管；髓線細胞呈類長方形、類方形及扁長方形；木部薄壁細胞，與導管伴生，細胞呈類長方形、類方形及扁長方形。中央為髓部，散見石細胞及草酸鈣方晶。
本組研究中，大青粉末除含有上述非腺毛、石細胞、方晶、導管、纖維外還具有少數腺毛和鐘乳體，而鐘乳體是馬鞭草科植物的一個顯著特征。另外纖維的種類也較豐富，因此粉末研究是生藥顯微研究中不可缺少的內容。由于大青在華南地區分布比較廣泛，但不同地區其有效成分的含量有所不同，其有效成分的含量高低直接影響其治療效果，而在熒光顯微鏡下可在木部薄壁細胞觀察到一圈顯著的綠色熒光，這可能是大青莖有效成分的存在部位，根據其熒光強度的不同可比較來源于不同地區的大青莖質量的優劣。
3.2 不同顯微鏡觀察大青莖粉末結構效果的比較
以往對生藥粉末形態觀察一般先采用水合氯醛透化，稀甘油裝片后再在普通光學顯微鏡觀察，由于受稀甘油等試劑的影響，觀察效果不是較理想，且觀察的結構形態一般平面狀態；但是在熒光顯微鏡下操作步驟簡便，生藥不須試劑處理，可直接用粉末裝片觀察，由于無甘油等試劑干擾影響，其視野潔靜，結構層次感較強。如所觀察的晶纖維、木栓細胞等，因此，整體效果要優于普通光學顯微鏡。更重要的是，在熒光顯微鏡下，有些結構可發出熒光，如大青莖粉末含有的不同纖維發出的熒光及亮度不一樣，為我們鑒別不同種類的生藥提供了重要的依據。
3.3 不同顯微鏡觀察大青新鮮葉結構效果的比較
在熒光顯微鏡下觀察新鮮大青葉片的下表皮，能夠清晰地觀察到氣孔的數量及腺毛、非腺毛，其次在葉片上觀察到其存在著一定數量的鐘乳體，立體狀的波紋狀角質層細胞也很容易觀察，另外可清晰地看到氣孔的開合狀態，在一定程度上利用熒光顯微鏡可代替掃描電子顯微鏡觀察上述葉片結構。關于氣孔類型，已有的關于馬鞭草科氣孔的觀察研究通過解離染色方法證明該科中氣孔類型較為豐富，有直軸式、平周式、不定式等［5］，但在熒光顯微鏡下葉片氣孔的類型不好判別，因此其有一定缺陷，而據我們在光學顯微鏡下將大青葉下表皮撕裂后加蒸餾水后觀察，大青葉氣孔類型很容易就能被判斷為無規則形，因此判別葉片氣孔的類型還需利用將下表皮撕裂或解離后等方法再在普通光學顯微鏡觀察才方便。
近年來，隨著新技術的不斷涌現，迅速地推動了中藥或生藥鑒定的發展［9，10］，關于生藥顯微鑒別儀器，常見的有普通光學顯微鏡、偏振光顯微鏡、掃描電子顯微鏡等，利用熒光顯微鏡進行化學成分組織定位也有報道［11］，但最常見的儀器是光學顯微鏡，在鑒別生藥方面熒光顯微鏡的使用還未見報道。我們利用熒光顯微鏡觀察黎族藥物大青莖粉末和新鮮葉片顯微構造是一次成功的嘗試，它為生藥顯微鑒定開拓了一條新的途徑，且操作簡便，無須任何試劑處理，保留了生藥的原樣，圖像更加直觀、清晰，值得深入研究。但也需要注意，有些部位熒光消失較快，需快速觀察。本組資料只探討了定性實驗問題，其他涉及到如何對化學成分進行定量等問題還需繼續探討，但是至少我們知道化學成分存在的部位，這為我們繼續改進實驗提供了契機。由于本次研究材料中無淀粉粒結構，其結構在熒光顯微鏡下效果如何？有待下次在其他材料中研究。
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中圖分類號 TH7 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6708（2016）166-0148-02
20世紀80年代以來，我國光學顯微鏡的設計發生了很大的進展，在其制作上，越來越注重實用性。為了改進光學顯微鏡的多功能方面，采用組合方式的裝配設計集普通光鏡加相差、暗視野、熒光、DIC、攝影裝置于一體，使光學顯微鏡在使用中操作方便且靈活[1]。倒置顯微鏡與此原理相同，也是結合其他技術達到使用功能的目的，根據倒置顯微鏡的用途可以分為生物倒置顯微鏡、偏光倒置顯微鏡、金相倒置顯微鏡、熒光倒置顯微鏡等種類，從而在諸多領域被廣泛使用。根據其使用功能特點，我們可以看出倒置顯微鏡技術具有極其寬闊的發展前景。
1 倒置顯微鏡技術的原理和具體操作
1.1 倒置顯微鏡技術的結構原理
倒置顯微鏡的結構主要由機械、光學和照明3個部分組成，每部分的功能組成都不相同，接下來我們將對其進行詳細介紹。
首先，在機械部分，與普通光學顯微鏡相似，主要有鏡座、鏡臂、觀察鏡筒、物鏡轉換器、載物臺以及調節器（包括粗螺旋和細螺旋）組成，在倒置顯微鏡中有著不用的功能作用，例如，鏡座是用以支持整個鏡體的一個底座；鏡臂是在取放顯微鏡的時候用來手握的部位；物鏡轉換器是可以調換不同倍數物鏡的結構；載物臺用以放置玻片標本；調節器是調節標本與物鏡相對位置的裝置。
然后，光學部分主要包括目鏡和物鏡。區別于正置顯微鏡的是，倒置顯微鏡的物鏡在觀察用品的下方，有4～6個，其中，刻有“10×”符號的物鏡較短，為低倍鏡，刻有“40×”符號的較長，為高倍鏡，最長的是刻有“100×”符號的油鏡[2]。而且，在油鏡和高倍鏡上經常會有一圈顏色不同的線，以示區別。目鏡裝在鏡筒的上端，目鏡上面分別刻有5×、10×、15×，表示其放大倍數，10×的目鏡較為常用。另外，顯微鏡的放大倍數是目鏡放大倍數和物鏡放大倍數的乘積，如物鏡為10×，目鏡為15×，其放大倍數就為10×15=150。
最后，照明部分分為透反射2種，透射式照明在載物臺的上方，提供明場、相襯、諾馬斯基干涉相襯等顯微術的照明；反射式照明安裝在物鏡的下方，提供熒光觀察、金相的明暗場觀察、偏振光觀察等；隨著高分辨成像技術的發展，研究級的倒置顯微鏡還配置了3～4個的外接照明端口，用于激光共聚焦、熒光漂白后恢復等模塊照明；通常倒置顯微鏡的照明系統均采用科勒照明，使均勻度達到80%以上。聚光器（集光器）的主要作用則是光線集中于所要觀察的標本上，其由聚光鏡和光圈2部分組成，位于鏡臺下方的集光器架上[3]。
1.2 倒置顯微鏡技術的具體操作
在倒置顯微鏡操作中，最常用的觀察方法是相差。這種方法在觀察活細胞和微生物的時候不需要染色，是一種比較理想的觀察方法。在此基礎上，提供各種聚光器來滿足需要，可以觀察到具有高對比度和對比度的自然背景顏色圖像。以下我們敘述一下倒置顯微鏡的具體操作流程。首先接連電源開機，打開鏡體下方的電控開關。在使用的之前，先把要觀察的對象放在載物臺上，轉動轉換器，選擇物鏡，然后進行觀察，調節鉸鏈式雙目目鏡到舒適的狀態為止，接下來開始推拉調節鏡下的亮度調節器至適宜光源狀態，再調節聚光鏡下面的光闌，調節光源大小。下一步是調節像距，即轉動物鏡轉換器選擇合適倍數的物鏡和目鏡的同時，調節升降來減小或消除圖像周圍的光暈，從而提高圖像的襯度。下一步就可以直接通過目鏡進行觀察了，在觀察過程中可以調整載物臺，選擇想要觀察視野。最后一步是關機：取下觀察對象，使用光源亮度調節器把光線調至最暗；然后關閉鏡體下方開關，斷開電源，轉動物鏡轉換器，把物鏡鏡片置于載物臺下側。
2 倒置顯微鏡技術的主要特點和應用
2.1 倒置顯微鏡技術的主要特點
根據倒置顯微鏡的結構分析和具體操作，我們可以發現倒置顯微鏡組成與普通顯微鏡相似，但其物鏡與照明系統顛倒，倒置顯微鏡在觀察培養的活細胞的時候，具有相差物鏡。倒置顯微鏡和放大鏡起的作用是相同的，就是把近處的一個微小物體放大成一個在人眼視力中清晰的圖像，但是，倒置顯微鏡比放大鏡的放大率更高。除了此特點，倒置顯微鏡的發展趨勢逐漸與光電轉換技術、計算機成像技術等技術結合，在使用中越來越方便靈活。根據其用途可以分為生物倒置顯微鏡、偏光倒置顯微鏡、金相倒置顯微鏡、熒光倒置顯微鏡等種類，在生物學、醫療科研等領域具有廣泛的應用價值。
2.2 倒置顯微鏡技術的主要應用
倒置顯微鏡種類較多，根據目鏡類別可分為單目倒置顯微鏡、雙目倒置顯微鏡和三目倒置顯微鏡，其中三目倒置顯微鏡的構造中，除了用于雙眼觀察的兩目，還有一目可以用來外接數碼相機或計算機，從而組成數碼相型倒置顯微鏡、電腦型倒置顯微鏡，而電腦型倒置顯微鏡可以分為生物倒置顯微鏡和金相倒置顯微鏡，根據其不同構造發揮的功能，不同的倒置顯微鏡應用的領域也有所不同。以倒置生物顯微鏡和金相倒置顯微鏡為例，倒置生物顯微鏡適用于生物領域，可以用來觀察細菌以及活體組織培養、生物切片、流質沉淀以及其他透明或者半透明物體、粉末、細小顆粒等物體，與普通生物顯微鏡相比較，倒置生物顯微鏡對附著培養皿底部和懸浮培養基中的活體物質具有高效的觀察功能，另外，倒置生物顯微鏡在食品檢驗、水質鑒定、晶體結構分析及化學反應沉淀物分析等領域也能發揮巨大作用。金相倒置顯微鏡的物鏡在工作臺下方，在使用金相倒置顯微鏡的時候不需要考慮所觀察物體非觀察面的平整情況，并且由于倒置的結構，工作臺面的上方比較空曠，也不用考慮所觀察物體的高低大小[4]。因此，金相倒置顯微鏡在金屬材料以及其它固體塊狀物體的工業企業研究中應用廣泛。不過，在工作臺下方的鏡頭十分容易沉積灰塵，因此金相倒置顯微鏡使用者需要勤加保養，以免由于鏡頭的污漬影響觀察效果。
3 倒置顯微鏡技術的發展趨勢
綜合以上對倒置顯微鏡的結構特點和主要應用來分析，我們可以看出倒置顯微鏡能夠供高?？蒲袑嶒灐⑨t療衛生單位等部門使用，可以用于細胞、微生物、細菌、組織培養、沉淀物、懸浮體等的觀察，能夠連續觀察并拍攝記錄細菌等生物在培養液中繁殖分裂的過程，在免疫學、細胞學、遺傳工程學、腫瘤學、寄生蟲學、工業微生物學、植物學等各個領域發揮十分重要的作用。接下來我們將根據倒置顯微鏡技術的具體應用情況，可以看出倒置顯微鏡技術的發展趨勢主要體現在倒置顯微鏡本身儀器精化、計算機系統應用于倒置顯微鏡技術和樣品制作方法3個方向，接下來我們將分析倒置顯微鏡技術在這3個方向的具體進程。
首先，在倒置顯微鏡儀器本身方面，可以將單一功能的儀器逐漸發展為多功能組合的大型儀器，提高儀器的使用效率，并且不斷精化各個部件儀器，有效提高其分辨率，能夠使倒置顯微鏡技術在實際應用中能夠觀察到更加精細的結構，推進微觀生物學的發展。其次，關于計算機技術與倒置顯微鏡技術相結合的方向，可以使科研能夠和信息時代的發展接軌，將計算機技術與倒置顯微鏡技術有效結合，促進儀器的操作技術準確化和科學化，促進圖像分析技術高度自動化，在方便倒置顯微鏡技術操作的同時，使倒置顯微鏡技術能夠更具有實用性和靈活性。最后，在樣品制作方面，要嚴格規范樣品制作的過程和環境，研制出特殊環境的樣品室和超高壓倒置顯微鏡，使用科學有效的方法，使研究的生物能夠在自然環境下完成動態過程，并觀察到自然狀態下的生物形貌，提高觀察研究成果的質量和效率。除此之外，在對倒置顯微鏡的保養方面，一定要注重各個零件構造的清潔和養護，以保證儀器的使用性能，從而延長顯微鏡的使用壽命。
1674年，列文？虎克研制發明出來了第一臺光學顯微鏡，從此以后，顯微鏡成為了人們觀測微觀世界的必不可少的工具，在各個學科領域中得到廣泛的應用并發揮了巨大的作用。隨著科技的發展和社會的進步，為了滿足各個領域科研對顯微鏡的需求，倒置顯微鏡技術作為一種新型的顯微鏡操作技術在各個科學領域應用后受到了極大的推崇?？茖W是沒有止境的，伴隨著倒置顯微鏡技術在生命科學教學、科研、醫療研究等方面的推廣，倒置顯微鏡技術會逐漸趨向成熟，使其在實際使用中更加方便靈活，具有更大的實用性和使用價值。
參考文獻
[1]沈思嗣，楊怡姝，王小利，李澤琳，曾毅. 配有電動載物臺倒置顯微鏡的操作[J].實驗室研究與探索，2010，29（12）：4-8.
白血病是造血干細胞克隆性疾病，是一組高度異質性的惡性白血病，嚴重威脅著人們的身體健康。急性白血病因分型不同，采用的治療方案也不同，療效和預后也不同[1]。急性白血病的診斷除依據臨床癥狀體征與血象外，骨髓細胞形態學檢驗是診斷急性白血病的主要依據和必要檢查。但是由于多種原因，導致白血病漏診、誤診的現象時有發生。因此本文通過多媒體顯微成像技術在骨髓細胞學檢驗中的應用，提高急性白血病的正確分型，從而更好的為白血病的診斷、確定治療方案、判斷預后、觀察療效服務。
1 對象與方法
1.1對象：選取56例臨床患者的骨髓片及外周血涂片進行觀察。器材：大眾世紀dz-510多媒體顯微成像儀；xsp-2ca雙目普通顯微鏡;瑞氏-姬姆薩復合染液；玻片等。
1.2 方法：（1）骨髓涂片：取有骨髓小粒部分，制備厚薄適宜、染色良好的骨髓涂片，同時做外周血涂片。（2）染色：采用瑞氏-姬姆薩復合染液進行骨髓涂片染色。（3）顯微鏡檢查：嚴格按照先低倍鏡視野后油鏡觀察的步驟，分別用雙目普通顯微鏡及大眾世紀dz-510多媒體顯微成像儀進行骨髓細胞形態學分析。
2 結果
2.1屏幕圖像與鏡下視野基本形態無異
通過與普通光學顯微鏡下的視野進行對比觀察，多媒體顯微成像分析系統可以清晰無損實時的顯示圖像，與鏡下觀察的視野基本形態無異，只是放大倍數增大。
2.2屏幕圖像比普通顯微鏡下的更加生動化化、清晰化
通過采集裝置（數碼ccd攝像頭）獲取的圖像更加生動、形象、直觀、動態的反映在顯示器上，使檢測者更方便、清晰地觀察、診斷采集圖像，甚至在高放大倍率的條件下，能看到在普通光學顯微鏡下難以觀察或觀察不到的圖像。
2.3能更快速、更準確的觀察骨髓片及外周血涂片
普通光學顯微鏡因受其放大倍率的限制，致使對骨髓涂片難于作出快速、準確的判斷分析。多媒體顯微成像技術中的屏幕圖像更易于觀察，比鏡下目視更方便、更快捷，而且更有利于多人對血液病進行共同分析判斷。
2.4對疑似患有血液病患者的骨髓涂片進行存儲、管理、傳輸
多媒體顯微成像分析系統不但能進行屏幕圖像觀察，更彌補了普通光學顯微鏡所不具有的存儲、管理、傳輸功能。它既可以建立大容量靜態圖片庫，可以無限保存采集下來的骨髓涂片和外周血涂片診斷結果，也可以通過圖像存檔與傳輸系統與醫院信息系統、個人健康檔案等聯網，實現復雜的查詢和全方位的統計，實現網絡遠距離傳輸，進行及時的會診和診斷疾病
2.5多媒體顯微成像技術的應用緩解了檢驗工作者的眼疲勞
作為檢驗工作者，首先，持續的鏡下目視工作，易使睫狀肌和眼外肌處于高度緊張狀態，導致睫狀肌痙攣，調節不能放松，引起眼干、眼澀、眼酸脹，視物模糊甚至視力下降，還會引發和加重各種眼??；再者，神經高度緊張會使眼睛發脹，視神經功能慢性減退，直接影響著檢驗工作者的工作與生活。屏幕圖像的直觀化、清晰化解決了普通顯微鏡難以觀察或觀察不到的現象，不但提高急性白血病的正確分型，更緩解了檢驗工作者在繁雜工作中的眼疲勞。
3 討論
白血病是造血干細胞克隆性疾病，是一組高度異質性的惡性白血病，嚴重威脅著人們的身體健康。急性白血病因分型不同，采用的治療方案也不同，療效和預后也不同[1]。急性白血病的診斷除依據臨床癥狀體征與血象外，骨髓細胞形態學檢驗是診斷急性白血病的主要依據和必要檢查。但是由于多種原因，導致白血病漏診、誤診的現象時有發生。因此本文通過多媒體顯微成像技術在骨髓細胞學檢驗中的應用，提高急性白血病的正確分型，從而更好的為白血病的診斷、確定治療方案、判斷預后、觀察療效服務。
1 對象與方法
1.1對象：選取56例臨床患者的骨髓片及外周血涂片進行觀察。器材：大眾世紀DZ-510多媒體顯微成像儀；XSP-2CA雙目普通顯微鏡;瑞氏-姬姆薩復合染液；玻片等。
1.2 方法：（1）骨髓涂片：取有骨髓小粒部分，制備厚薄適宜、染色良好的骨髓涂片，同時做外周血涂片。（2）染色：采用瑞氏-姬姆薩復合染液進行骨髓涂片染色。（3）顯微鏡檢查：嚴格按照先低倍鏡視野后油鏡觀察的步驟，分別用雙目普通顯微鏡及大眾世紀DZ-510多媒體顯微成像儀進行骨髓細胞形態學分析。
2 結果
2.1屏幕圖像與鏡下視野基本形態無異
通過與普通光學顯微鏡下的視野進行對比觀察，多媒體顯微成像分析系統可以清晰無損實時的顯示圖像，與鏡下觀察的視野基本形態無異，只是放大倍數增大。
2.2屏幕圖像比普通顯微鏡下的更加生動化化、清晰化
通過采集裝置（數碼CCD攝像頭）獲取的圖像更加生動、形象、直觀、動態的反映在顯示器上，使檢測者更方便、清晰地觀察、診斷采集圖像，甚至在高放大倍率的條件下，能看到在普通光學顯微鏡下難以觀察或觀察不到的圖像。
2.3能更快速、更準確的觀察骨髓片及外周血涂片
普通光學顯微鏡因受其放大倍率的限制，致使對骨髓涂片難于作出快速、準確的判斷分析。多媒體顯微成像技術中的屏幕圖像更易于觀察，比鏡下目視更方便、更快捷，而且更有利于多人對血液病進行共同分析判斷。
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2.4對疑似患有血液病患者的骨髓涂片進行存儲、管理、傳輸
多媒體顯微成像分析系統不但能進行屏幕圖像觀察，更彌補了普通光學顯微鏡所不具有的存儲、管理、傳輸功能。它既可以建立大容量靜態圖片庫，可以無限保存采集下來的骨髓涂片和外周血涂片診斷結果，也可以通過圖像存檔與傳輸系統與醫院信息系統、個人健康檔案等聯網，實現復雜的查詢和全方位的統計，實現網絡遠距離傳輸，進行及時的會診和診斷疾病
2.5多媒體顯微成像技術的應用緩解了檢驗工作者的眼疲勞
作為檢驗工作者，首先，持續的鏡下目視工作，易使睫狀肌和眼外肌處于高度緊張狀態，導致睫狀肌痙攣，調節不能放松，引起眼干、眼澀、眼酸脹，視物模糊甚至視力下降，還會引發和加重各種眼?。辉僬?，神經高度緊張會使眼睛發脹，視神經功能慢性減退，直接影響著檢驗工作者的工作與生活。屏幕圖像的直觀化、清晰化解決了普通顯微鏡難以觀察或觀察不到的現象，不但提高急性白血病的正確分型，更緩解了檢驗工作者在繁雜工作中的眼疲勞。
3 討論
一半是技術，一半是生物
馬炯1999年進入復旦大學物理系，2008年取得物理系光學專業博士學位。博士階段開始，馬炯就致力于發展光學技術與生物課題相結合的研究工作。期間他曾作為訪問學者前往南非羅德斯大學化學系和挪威奧斯陸大學生理系進行學術交流。
在南非期間，他確認水溶性CdTe量子點的光催滅機理，首次測定其單態氧產量，并開創出一種應用于其實現光動力治療癌癥的方法。2008年赴美從事博士后工作后，他一直致力于發展新型的單分子超分辨熒光顯微鏡，用于細胞核孔復合物的研究工作。在美國，馬炯與Yang教授共同開發了SPEED顯微技術，并在10nm空間精度和400μs時間精度下，研究了各類分子穿越細胞核孔的選擇機制。他首次觀測到細胞核孔內非折疊蛋白的三維結構，并首次獲得生物小分子穿越細胞核孔三維路徑，確定了其間的選擇性機制，并于2010年及2012年在Proceedings of the National Academy of Sciences上發表了兩篇高質量論文。
馬炯還與Walter教授合作，開發應用于超分辨顯微鏡的mRNA熒光標記系統，結合單分子顯微追蹤技術，完成了mRNA穿越核孔的選擇機制的初步研究，確認了mRNA核孔輸出三維路徑，糾正了一維路徑數據所造成的認知誤解，并發表在Nature Communication上。
而談到技術和生物研究，馬炯說他從來沒有糾結兩者之間的取舍，而是始終游走在兩者的平衡之中。曾經在南非和挪威做訪問學者的時候，他感到技術上偏重太多時，就在前去美國的時候有意識地加重了生物研究的選擇。技術是他的“技”，而生物就是他的“巧”。有技方成巧，通過超分辨率光學顯微鏡的技術不斷提高，他在細胞核孔復合物領域的研究也不斷加深；以巧推動技，通過細胞核孔復合物實驗研究的需求，他又不斷革新超分辨光學顯微鏡的技術。雙子的多面性，他展現在了科研領域中，并且大獲成功。
2015年6月，馬炯歸國。他坦言，歸國的一部分原因是因為故鄉的父母，另一部分則是國家現在對于青年學者的重視，能夠讓他在最有精力的時刻投入到科研中去。“能夠為國家做一點事情，國家也重視我做的事情，這當然是再好不過了。”馬炯笑言。
超分辨光學顯微鏡下看世界
顯微鏡的發展滿足了人們對觀察微觀世界的需求，讓人們可以看得越來越“小”。但由于衍射極限的存在，幾十年來光學顯微鏡的分辨率停滯在了200nm左右。2014年諾貝爾化學獎頒發給了美國及德國三位科學家Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E. Moerner，獲獎理由是“研制出超分辨率熒光顯微鏡”。幾位獲獎者巧妙設計了避開衍射極限的方法，其研究突破性地將光學顯微鏡帶入了納米維度。在納米顯微鏡下，科學家實現了活體細胞中單個分子通路的可視化，能夠觀察到分子是如何在大腦神經細胞之間生成神經突觸；可以追蹤帕金森病、阿爾茲海默癥和亨廷頓癥患者體內相關蛋白的累積情況；還能跟蹤受精卵在分裂形成胚胎時蛋白質的變化過程?，F在已經進入了“光學顯微鏡2.0”的時代，超分辨熒光顯微鏡推動著新一輪生物醫學的飛速發展。
現今，已具有多種不同超分辨成像技術實際應用于生物系統的范例，也已出現了商業化的超分辨顯微鏡系統，但仍然沒有達到完美狀態。在許多生物研究中，各類超分辨系統有著各自的局限性，如對于特殊熒光標記的發光特性依賴，或是高空間精度測量制約了探測時間進一步縮短。因此，研究和發展合適新的原理和方法，研制出適合專項生物課題研究的顯微鏡將是今后發展的一大方向。
談起二維到三維的超分辨退卷積計算開發的時候，馬炯說起了一個有意思的故事：他做出這個開發之后，花了整整一個星期的時間說服他的老師來相信他的成果，因為他的老師根本無法想象有人可以做出從二維分布中獲取系統的三維分布的開發。而當他的老師認可了他的成果，他和他的老師又開始一起說服領域里的其他研究者一起應用這項成果的相關研究人員?！斑@告訴我們，固化思維的可怕。科技要進步，科研人員要創新研究，首先就要從打破自己的固有傳統認知開始?！瘪R炯嚴肅地說。
歸國后的馬炯將開始著手建立顯微鏡第二平臺熒光返還探測技術，實現兼具超高的時間和空間分辨率的三維分子熒光追蹤系統。他將把研究中所獲得的信息將與跟蹤RNA輸出細胞核孔的研究互相印證，通過分析RNA在細胞核孔各位置的高時空精度動態過程，進一步研究細胞核孔蛋白調控基因的機理。此外，研究中所發展的原理和方法還將能夠被廣泛用于毫秒量級甚至更快的纖毛內分子運輸、細胞間分子交換及跨膜通道開關等生物問題的研究。
在研究中，馬炯將采用創新技術，促使實驗系統同時具有很高的時間和三維空間分辨率，在不影響平面二維光學分辨精度的前提下，不通過擬合點擴散函數，而在亞毫秒級時間分辨量級和10nm三維空間分辨量級，實現對三維單分子熒光信息的實時探測和分析，滿足高速動態生物學研究的特點和條件。在新型光學系統中，他還將利用凹面鏡返還光程無色差的光學原理，創新設計凹面鏡熒光返還光路系統，能夠將z方向信息轉換成x-y水平方向的信息，從而獲取單分子z方向的位置信息。
細胞核孔復合物探尋
在細胞核孔復合物的研究中，馬炯將利用SPEED顯微鏡技術，完成各類FG屏障與各類主要的傳輸分子間反應區域的三維分布測量。細胞核孔復合物是真核細胞中連接細胞質和細胞核之間的選擇性雙向通道，控制著絕大部分細胞核所需的蛋白輸入，以及核內基因物質的輸出?？梢哉f，核孔是細胞內基因調控中非常重要的一個環節。核孔的缺陷會導致核孔相關的白血病及阿爾茲海默癥等疾病。其本身更是各類病毒侵入細胞的重要關口之一，各類病毒會通過不同的方式通過核孔，最終侵入細胞的基因表達系統導致疾病發生。核孔的結構與功能的研究將為各類基因調控機制的研究提供一環重要的依據，對核孔蛋白缺失相關的白血病、阿爾茲海默癥的致病機制，以及各種類病毒的侵入機制等核孔相關病理機制或基因治療提供關鍵信息。
一個NPC是由30種多不同的核孔蛋白構成，長約200nm、直徑為120nm、中心內徑為50nm的大分子復合物。其中有三分之一的核孔蛋白富含苯丙氨酸-甘氨酸（FG）氨基酸片段，且在自然狀態下呈現出非固定形態，我們稱之為FG-Nups。這些FG-Nups組成了具有選擇性機制的FG屏障。FG屏障選擇性地調控基因相關物質按照被動運輸或者主動介入運輸的方式進出細胞核：只有小于60kDa的分子才能通過被動運輸的方式，自由擴散通過NPC；另一種方式是主動運輸，如含有入核信號或者核孔輸出信號的蛋白或復合物分子，在核孔運輸蛋白幫助下，形成復合物，通過TRs與FG片段相互作用，從而通過FG屏障。TRs與需要傳輸的蛋白形成的復合物的結合與解離，通過細胞核內外的RanGDP和RanGTP的濃度梯度來調節。通過電子顯微鏡可以觀察到細胞核孔結構蛋白，但卻無法獲得這些高度自由的非折疊蛋白的結構，所以至今在生理狀態下FG屏障及其相關的核孔物質傳輸的機理仍不清楚。
馬炯將利用SPEED顯微鏡技術，完成各類FG屏障與各類主要的傳輸分子間反應區域的三維分布測量。他將確認活細胞內FG-Nup相互反應的存在及相應的水凝膠分布。綜合各反應分布，完成接近完善的FG屏障的完整分布。他還將利用基因敲除，獲取缺失核孔蛋白的分布，理解其對白血病的致病機理及對腺相關病毒（AAV）基因療法的調控機制。從傳輸蛋白間的競爭情況，了解細胞核孔在大通量物質運輸下對應的優先選擇機制。
達成這項研究的基礎，是SPEED顯微技術能在超短的時間內獲得高精度的空間位置信息，調控光學設置的穩定和準確，以及對各不同分子不同擴散速率下，在確保單分子熒光定位精度的同時，優化實驗條件獲取最多的數據量，是實驗成功的關鍵。擁有豐富的超分辨光學經驗，這讓馬炯能夠滿足數據的準確性及穩定地產出量。據此，他將創新領先技術，努力實現分子競爭通過核孔的實驗設計創新。
未來故事
回國后的馬炯選擇了他的母校復旦大學作為科研工作的新起點。這里熟悉的環境讓他很快就進入到了工作當中并規劃新的征程。
首先，馬炯將繼續提升SPEED顯微技術的性能及推廣其應用范圍。所有的對稱體系研究中，馬炯的SPEED顯微技術都可以推廣應用。而在快速跟蹤領域中，這項技術也具有明顯優勢。其次，他將繼續完善超快速的實時單分子三維追蹤。再次，馬炯將提高靜態單分子熒光定位下的超分辨圖像精度?，F在的主流超分辨顯微鏡是用了一種光開關蛋白來實現，這將會造成單位時間內的信號光的損失。馬炯換了其他方式，利用分子運動進特定區域時將這個分子可能發出的所有熒光進行收集，從而提高靜態單分子熒光定位下的超分辨圖像精度。
