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【中圖分類號】R739.8 【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）03-0456-01
1 口腔鱗狀細胞癌簡介
口腔鱗狀細胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其好發部位依次為舌、牙齦、頰、腭、唇、口底。鱗狀細胞癌以角化珠形成及出現細胞間橋為病理學特征。腫瘤來自表面口腔黏膜上皮，腫瘤性上皮團或上皮島浸潤下方結締組織，細胞特征可表現為豐富的嗜酸性胞質，胞核、核漿比大，程度不同的細胞及胞核的多形性，鱗狀上皮形成的角化珠和單細胞的角化均可見。OSCC占口腔頜面部癌瘤80%以上，患者5年生存率約為50%，對于腫瘤晚期和復發患者，生存率更低[1]。因此尋找有效的治療方法十分重要。經過過去幾十年的發展，手術、放療及化療并沒有顯著提高口腔癌患者的生存率，化療藥物有明顯的副作用，而且對復發的口腔癌患者生存率的影響尚不明確。研究新的治療方法顯得尤為關鍵。
許多研究表明：惡性腫瘤的治療中，免疫治療一直走在前沿，口腔癌患者特別是鱗癌患者，其細胞免疫功能早期就不同程度地受到傷害，再加上常規治療方法（手術、放療、化療等）又可導致機體免疫功能的進一步下降。因此，口腔癌腫的最佳治療策略應是包括免疫治療在內的綜合療法。隨著人類基因組計劃的完成和口腔鱗癌發病功能基因的不斷探明，腫瘤基因治療這一生物治療手段越來越受到大家的認可。自從1988年Rosenberg[2]提出要將腫瘤免疫基因治療原理實際應用于臨床起，學者們就對腫瘤的免疫基因療法展開了深入的研究。
2腫瘤免疫基因治療的概念
廣義的腫瘤基因治療概念認為，凡是能夠改變腫瘤細胞或其他體細胞的遺傳物質結構或功能，而達到治療腫瘤目的的方法均屬于腫瘤基因治療的范疇。為區別傳統的化療及放療導致的遺傳物質結構或功能（核酸）變化，將腫瘤基因治療定義為：以適當的基因轉移技術將特定的外源遺傳物質導入腫瘤細胞或患者體內，通過外源遺傳物質的表達產物或對宿主細胞本身遺傳物質表達的影響，直接或間接地殺傷或抑制腫瘤細胞[3]。從基因操作角度看，基因治療主要有四種方法，及基因修正、基因置換、基因失活和基因修飾。近年來，免疫基因療法在腫瘤的治療中得到廣泛應用。
腫瘤免疫基因治療是依賴于機體免疫功能的間接殺傷。腫瘤免疫基因治療的定義為：根據免疫學的理論論技術建立的、以基因轉移技術為基礎的、以激發機體腫瘤免疫效應或提高免疫效應細胞功能為目的的基因治療方法。免疫基因治療的發展反映了整個腫瘤基因治療歷史，首例得到美國FDA批準的腫瘤基因治療的臨床計劃是由Rosenberg[4]提出，用細胞因子基因體外轉導修飾TIL，最后回輸患者體內，治療晚期惡性腫瘤病人。
3免疫基因治療的方法
基因治療在口腔鱗癌中的治療前景包括用于治療口腔鱗癌的復發和輔助治療，例如作為外科手術后的輔助措施；發生局部遠處轉移的口腔癌患者也是基因治療的應用方向之一。盡管全身用藥理論上可以到達轉移的病灶，但是基因治療不適宜于全身輸送。因為大多數原發和復發病灶是很表淺的，因此口腔癌患者非常適宜局部直接注射治療。目前研究的用于治療口腔鱗癌的方法包括：1）添加抑癌基因-基因添加療法；2） 去除缺陷腫瘤基因-基因去除療法；3） 減少刺激腫瘤生長的基因的表達-反義RNA；4） 增強免疫監測-免疫療法；5） 前體藥物活化起到化療效應-自殺基因療法；6） 病毒破壞腫瘤細胞的復制周期；7）呈送抗藥基因給正常組織以防止化療損傷。
4口腔癌癌基因的研究
迄今人們已在脊椎動物細胞中確定了32種與逆轉錄病毒癌基因同源的細胞癌基因，其中20多種與腫瘤發生有關。研究口腔癌癌基因的表達以及癌基因產物的形成，對從分子水平認識口腔癌的發病機制和生物學行為具有重要意義。Hoellering[5]等采用生物素化的H-ras，cDNA探針原位雜交技術和免疫組化技術，對5例口腔癌患者腫瘤組織中H-ras癌基因的mRNA及其產物P2蛋白進行定位研究，發現H-ras癌基因與mRNA的分布可能與口腔癌的生長方式及預后有關。且發現晚期口腔癌組織中均有ras和myc家族癌基因的擴增。在口腔鱗癌中，c-myc表達量較正常組高2～5倍，平均水平為0.34±0.16pg /μg，其它與口腔腫瘤有關的癌基因還有c-erb-B2、fes、mos、myb等，其中ab1基因在口腔上皮癌細胞株的表達與其脫壁生長特征有關。進一步研究口腔腫瘤中癌基因的各種變化，無疑對揭示口腔腫瘤的發生機制和指導免疫基因治療具有重要意義。
5 口腔鱗癌的免疫基因療法
免疫基因療法治療口腔癌有兩種途徑：一是增強腫瘤細胞的致免性，一是提高患者對腫瘤的免疫反應性。研究表明頭頸部鱗癌患者有數種免疫細胞功能缺陷，包括自然殺傷細胞、T細胞、以及一些細胞因子。盡管口腔癌沒有經典的免疫性，但是很多證據表明其具有免疫識別功能。已進行的動物研究包括給予IL-2誘導產生LAK細胞、TNF- A，將 IL- 2、IL- 4、IFN- C、IL-6或IL-1B轉入腫瘤起到免疫調節作用聯合應用非病毒脂質體表達的鼠白介素 2和多聚體表達的mIL- 12治療口腔鱗癌，試驗證明是可行并有效的[6]。mIL-2和mIL-12聯合運用產生明顯的抗腫瘤效應可能是由于其刺激增強了Tc細胞和NK的活性。此外，最新研究表明，應用缺陷型反轉錄病毒載體能夠將TNF-α基因導入口腔鱗癌DNL中，帶有TNF-α基因的DNL能夠分泌高活性的TNF-α，表明口腔鱗癌DNL可作為基因轉移的運載細胞用于口腔鱗癌的細胞因子基因治療。
5.1 細胞因子與免疫基因治療
在當前所開展的基因治療研究中，免疫基因治療的研究多集中于細胞因子基因治療的研究。細胞因子的基因治療避免了以往細胞因子注射療法需反復多次給患者或動物模型注射大劑量細胞因子所帶來的不良反應，也取得了細胞因子注射療法所不具備的治療效果。細胞因子基因治療所選用的目的基因是可以編碼表達包括ILs、IFNs、CSFs及TNFs等在內的各種細胞因子及其受體的基因[7]。依據將細胞因子基因導入體內的途徑和原理不同，細胞因子基因治療可分為以下幾類：（1）以免疫效應細胞為基礎的細胞因子基因治療；（2）以瘤苗為基礎的細胞因子基因治療；（3）以抗原呈遞細胞為基礎的細胞因子基因治療；（4）成纖維細胞等受體細胞為基礎的細胞因子基因治療；（5）直接體內注射途徑的細胞因子基因治療。
5.2 抗體與免疫基因治療[8]
（1）抗體增強免疫基因治療的靶向性：解決免疫效應細胞識別腫瘤細胞的特異性是腫瘤治療的關鍵之一，研究表明將腫瘤特異性單鏈抗體基因導入T細胞中，使之分泌抗體，一方面通過抗體殺傷腫瘤細胞；另一方面通過抗體使特異性結合增加。
（2）抗體作為免疫基因治療的效應分子：胞內抗體可用于腫瘤治療。美國學者構建了一種編碼單鏈抗體的載體（PGT21），將此載體轉入高表達erbB2的卵巢癌細胞株SKOV3細胞中，可以通過胞內表達抗體erbB2單鏈抗體，抑制瘤細胞的生長。
（3）抗原與免疫基因治療：在腫瘤治療方面，經FDA批準，已有學者將編碼CEA、Ig基因表達載體直接導入結腸癌和口腔鱗癌患者體內，臨床顯示其有一定抗腫瘤效應。
5.3 綜合性免疫基因治療
有研究表明，單一途徑的免疫基因治療效果并不理想，因此，將相互間有相加或協同效應的不同方法聯合起來治療口腔鱗癌的臨床效應值得嘗試。目前主要的研究方向有：細胞因子基因治療與細胞因子基因治療的聯合；細胞因子基因治療與B7等共刺激分子基因治療聯合；細胞因子基因治療與MHC基因治療聯合；④細胞因子基因治療與抗原基因治療聯合；⑤細胞因子基因治療與自殺基因聯合治療。
6展望
綜上所述，口腔頜面鱗癌免疫基因療法發展至今，經歷了從單一途徑療法轉向多途徑聯合治療的階段，進一步提高了臨床療效。伴隨著新的免疫基因療法的不斷問世，基因聯合療法的治療效果更加明顯，且不良反應也大大降低。同時，結合口腔鱗癌術前術后輔助療法是可行的治療方式，并有望進一步提高生存率。比較同期不同心的聯合基因療法的隨機試驗仍在進行中，這些試驗將可能為治療口腔頜面部鱗癌患者治療中的作用確立1個新的位置。另外口腔鱗癌往往伴有第二原發腫瘤的風險，已經成為影響患者長期生存率的重要因素之一。免疫基因療法對于第二原發腫瘤的影響如何，有待進一步研究。
免疫基因治療是一種新興的治療腫瘤的方法。隨著腫瘤分子生物化學研究的不斷深入，我們能夠拓展基因治療腫瘤的方法，選擇性針對腫瘤細胞。由于口腔鱗癌基因突變頻繁，位置表淺易于瘤內給藥，因此基因治療適合運用于口腔鱗癌。基因療法用于Ⅰ期的頭頸部鱗癌是安全有效的；對于Ⅱ期鱗癌，聯合放療或化療，也能起到抗瘤效應；作為輔助措施治療Ⅲ期鱗癌的正在進一步研究中。以后的研究方向在于建立起安全有效的利用免疫基因療法治療口腔鱗癌的方法體系。
參考文獻
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肺癌是常見的惡性腫瘤之一,目前治療是以手術、化療、放療為主,聯合生物治療、中醫中藥治療等的綜合治療模式,但隨著腫瘤分子生物學、免疫學以及分子生物學技術的發展,肺癌生物治療不斷被賦予新的內容,治療方法逐漸擴展到基因治療、免疫治療以及近年來興起的分子靶向治療[1],為肺癌治療開辟了更為廣闊的前景。本文就肺癌生物治療的現狀及研究進展綜述如下。
1 肺癌生物治療現狀
生物治療的原理是通過為腫瘤患者補充具有殺死、抑制腫瘤能力的免疫細胞和能力,調節患者自身免疫功能,達到控制和清除腫瘤細胞的目的,主要包括細胞因子技術、基因治療技術、腫瘤疫苗技術、免疫活性細胞繼承性輸注技術、單克隆抗體及其耦聯物技術等[2],彼此之間并沒有明確的界限,它們的出現標志著腫瘤生物治療體系的基本形成,雖然途徑與方法各異,但目的都是通過最大限度的利用人體自身所具有的抗腫瘤能力來治療惡性腫瘤。生物治療有自己獨特的優點,毒副反應較低.僅在高劑量時有低血壓、發熱皮疹、抗原抗體反應等,發生率較低[3],臨床上治療肺癌應用最多的為細胞因子,免疫調節劑、基因治療和分子靶向治療藥物也已應用于臨床,過繼免疫細胞中淋巴活化殺傷細胞(LAK)已見報告,為今后生物治療的發展研究提供了豐富的內容。
2 肺癌生物治療研究進展
2.1 分子靶向治療腫瘤分子靶向治療是利用分子靶向藥物特異性,以腫瘤組織或腫瘤細胞中所具有的特異性分子為靶點,阻斷該靶點的生物學功能,或選擇性從分子水平來逆轉腫瘤細胞的惡性生物學行為,從而達到抑制腫瘤生長甚至腫瘤消退的目的[4]。其中以表皮生長因子受體(EGFR)和腫瘤血管生成作為靶點的藥物占60%,以表皮生長因子受體作為靶點的治療藥物包括吉非替尼、埃羅替尼、西妥昔單抗等,以腫瘤血管生成作為靶點的治療藥物包括貝伐單抗、ZD647、內皮抑素、基質金屬蛋白酶等,其它靶向治療藥物如基質金屬蛋白激酶(MMPs)抑制劑、血管生成因子抑制劑、法尼基轉化酶抑制劑(FTIs)、環氧化酶抑制劑、組氨酸脫乙酰化酶抑制劑等分子靶向性藥物正在進行臨床前或臨床試驗研究中[5]。
2.2 細胞因子治療 常用于肺癌的細胞因子有干擾素(IFN)、白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、紅細胞生成素(EPO)和集落刺激因子(CSF)等。細胞因子的應用是目前最成熟的生物治療方法,尤其是IFN和IL,目前已經在肺癌治療中應用非常成熟,CSF、TNF、EPO等也逐漸被廣泛應用,在腫瘤的治療中起到了重要作用。IFN是最早發現具有抗癌效應的細胞因子,早在1980年第一次用于小細胞肺癌(SCLC)的實驗中就顯示出了良好的前景。IL一24是近來發現的一種新白介素,利用腺病毒轉染的方法發現其可以抑制肺癌細胞的增殖并可以增強肺癌細胞對放療的敏感性。CSF及EPO的應用對于克服骨髓抑制、預防傳統放化療所產生的白細胞下降及紅細胞減少無疑起到了保駕護航的作用,為提高放化療藥物的使用劑量從而達到更好的治療效果起到了關鍵作用[6]。
2.3 免疫治療 主要包括腫瘤疫苗、過繼性免疫治療及補充細胞因子,其中發展最快的是腫瘤疫苗。目前應用的肺癌疫苗有腫瘤細胞疫苗、胚胎抗原疫苗、病毒疫苗、癌基因產物疫苗、人工合成多肽疫苗、抗獨特型疫苗和樹突狀細胞疫苗等,樹突狀細胞疫苗能形成強有力的特異性細胞免疫應答,有效地清除血源性播散的肺癌細胞,發展最為矚目[7],Ueda等應用CEA652體外沖擊致敏樹突細胞,治療CEA陽性的肺腺癌患者,發現治療后患者病情穩定,血清中CEA水平明顯降低。受到重視的還有第3代疫苗:核酸疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗, DNA疫苗在體內可持續高表達相應抗原,被樹突細胞攝取并致敏后,激發高效的細胞和體液免疫反應,是最有潛力的腫瘤疫苗發展方向。
2.4 基因治療
2.4.1p53基因治療 在基因治療研究中,以腺病毒轉染抑癌基因p53的表達研究較為成功。國外對重組腺病毒介導的p53基因治療NSCLC的臨床研究已基本完成,結果顯示腺病毒p53注射液在NSCLC中有抗瘤活性。一項研究中,對12例氣道阻塞且無法手術的肺癌患者瘤內注射重組腺病毒p53注射液106―1011pfu,28天重復一次,其中6例患者癥狀得到緩解。然而也有研究者將重組腺病毒p53注射液聯合化療治療NSClC,發現兩組療效和生存期無顯著差異。
2.4.2 殺傷基因將具有殺傷作用的基因片段導入細胞復制的DNA序列中,從而打斷細胞基因的連續性,抑制基因的過量表達和腫瘤細胞的增殖。自殺基因和凋亡基因通過引發腫瘤細胞的凋亡而起到殺傷腫瘤細胞的作用。TK基因-GCV系統是最有希望在臨床上用于腫瘤基因治療的方法之一,在肺癌基因治療中具有顯著作用。
2.4.3 RNAi技術 在針對腫瘤的基因治療策略中,RNAi技術以其自身的諸多優勢,在不影響正?；蚬δ艿那疤嵯?可以針對在細胞癌變過程中發揮重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相關基因、血管生成因子及其受體以及部分關鍵酶等,抑制突變基因表達或基因的過量表達。如Zhang等用HER-1 siRNA抑制了肺癌細胞A549的EGFR的表達,使肺癌細胞比對照組細胞數減少了85%,EGFR蛋白表達下降了70%以上,對順鉑的敏感性增加了4倍。
3 展望
作為一種新的治療模式,生物治療目前還存在很多問題,如各種治療藥物的有效性、安全性還有待于進一步評價,是否有必要采用特異性檢測手段篩選分子靶向藥物的適應人群來實現個體化用藥,及建立這類藥物與手術、放化療之間的最佳聯合方案還需不斷摸索。但我們深信在不久的將來,隨著對腫瘤生物學特性和行為了解的不斷加深、分子藥物研究的不斷發展,將會出現一批新型的低毒、高效靶向治療藥物,為肺癌乃至其他所有腫瘤患者帶來福音。
參考文獻
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[3] 廖羨琳.肺癌生物治療臨床進展[J].實用腫瘤雜志,2001,16(4):221.
Abstract
AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.
METHODS:At first，the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC，GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.
RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis，there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P
CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.
KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV
自殺基因治療是近年來腫瘤研究的熱點領域之一，也是目前最有可能有效應用于臨床的腫瘤基因治療策略之一。構建安全高效的載體是基因治療的關鍵。我們已經成功的構建了含有hTERT啟動子的腫瘤特異性殺傷載體pcChCDTK[1]。我們將探討該載體對人視網膜母細胞瘤Y79細胞在體外的作用。
1材料和方法
1.1材料
Y79細胞株[美國模式菌種收集中心(ATCC)];RPMI1640細胞培養基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU，GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL試劑盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);雙丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白質Marker(上海生化試劑公司);實驗所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。
1.2方法
將經過證實的含有pcChCDTK質粒的JM109菌液0.2mL接種到200mL含50mg/L氨芐青霉素的LB培養基中，37℃，280r/min的搖床上培養16h，將菌液轉移到離心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步驟進行操作提取質粒pcChCDTK，干燥后，加無菌水溶解質粒300μL，用Duc 640分光光度計測定DNA含量，20℃分裝保存。用RPMI1640培養液培養Y79細胞，每日在倒置相差顯微鏡下觀察。Y79細胞懸浮生長，培養中細胞可聚集成團并沉集于培養瓶底部，當細胞基本鋪滿瓶底即可傳代，按照1∶2～1∶4傳代。將傳代后的Y79細胞培養24h后，細胞進入對數生長期，即可用于電轉化。未轉染Y79細胞生長迅速，傳代后培養24h后，細胞進入對數生長期。取上述進入對數生長期并基本鋪滿瓶底的細胞，在22℃，1000r/min的條件下，離心10min，收集細胞。用0.01mol/L PBS 10mL重懸細胞，取細胞懸液20μL，用細胞計數板計數，其余細胞在22℃，1000r/min條件下，離心10min，重新收集細胞;根據計數結果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重懸細胞。取800μL細胞重懸液加入到含有pcChCDTK質粒20μg的EP中，吹打混勻，然后轉入0.4cm的電擊杯中，以2kV，25μF的條件進行電擊。電擊后，迅速將電擊產物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液的75cm2培養瓶中，置37℃，50mL/L CO2的細胞培養箱內培養。電轉染后的Y79細胞生長與未轉染細胞相似。倒置相差顯微鏡下見細胞懸浮生長，形狀飽滿，色澤鮮亮，聚集成團。
1.2.1 CDTK基因表達的檢測
提取Y79細胞RNA;參照reverse transcription system kit進行RTPCR反應;取逆轉錄產物2μL作為模板，以yCDrt和TKrt為引物擴增CDTK，同時用βactin擴增引物作對照，RTPCR產物用8g/L瓊脂糖凝膠跑膠檢測。另取未轉染的Y79細胞設為對照，同法處理。取轉染48h和未轉染的Y79細胞預處理;固定玻片;配制分離膠和堆積膠;上樣;跑膠;轉膜;封閉;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;顯色;曝光。
1.2.2 5FU濃度的檢測
人視網膜母細胞瘤細胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培養液在37℃，50mL/L CO2細胞培養箱中正常培養。細胞在轉染腫瘤特異性殺傷載體pcChCDTK前24h換液，調整細胞密度使之在轉染時達基本鋪滿瓶底。將細胞在22℃，1000r/min的條件下，離心10min，收集細胞，用適當體積的無血清的RPMl1640培養液重懸，細胞計數，使之密度為6.25×109/L。取細胞懸液800μL加入自殺基因載體pcChCDTK 20μg，將其混勻，轉入0.4cm的電擊杯中，以2kV，25μF的條件進行電擊。電擊后，細胞接種入培養瓶中培養，24h后收集細胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培養液配成細胞懸液，以每孔2×105個細胞的濃度植入24孔板，每孔培養液體積1mL。24h后加入前體藥物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其細胞上清，用高效液相色譜儀(HPLC)檢測其5FU的濃度。配5FC及5FU標準品的濃度梯度做標準曲線。LC10A高效液相色譜儀;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm，150mm×4.6mm，ID);預柱YWGODS(10μm，10mm×4.6mm，ID);流動相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;檢測波長266nm;柱溫37℃。10μL進樣。
1.2.3前體藥物對細胞毒性的檢測
采用Western Blot技術檢測新融合自殺基因CDTK在視網膜母細胞瘤Y79細胞中的蛋白質水平表達。人視網膜母細胞瘤細胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培養液在37℃，50mL/L CO2細胞培養箱中正常培養。以2×105個細胞的密度將細胞接種到96孔板中培養，每孔體積200μL。24h后，加入不同濃度的前體藥物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每個濃度梯度有4孔。留1孔不加細胞，只加培養液做空白對照孔。在37℃，50mL/L CO2的條件下，細胞不換液培養5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，繼續孵育4h，終止培養，吸去培養上清液。每孔加入DMSO 150μL，振蕩10min，使結晶物充分溶解。比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上調定各孔吸收值。以每天進行換液的細胞做對照，假設細胞存活率為100%，將其它各細胞孔的吸收值與其比較得出各處理組細胞的平均存活率。另視網膜母細胞瘤細胞在轉染前24h換液，調整細胞密度使之在轉染時達基本鋪滿培養瓶底。將pcChCDTK載體電轉染Y79細胞。電擊后，細胞接種入培養瓶中培養，24h后，收集細胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培養液配成細胞懸液，以每孔2×105個的密度植入96孔板中培養，每孔體積200μL。24h后加入不同濃度的前體藥物100μL，5FC+GCV以兩藥的對應濃度加入96孔板，每個濃度梯度有4孔。留一孔不加細胞，只加培養液做空白對照孔。然后用MTT法檢測細胞存活率。統計學分析：所得數據用SPSS 11.5統計軟件包進行統計，采用StudentNeuman Keuls(SNK)檢驗，以P
2結果
2.1 Y79細胞轉染后CDTK基因的表達
RTPCR檢測結果顯示，轉染組可見一403bp特異條帶，與預期大小一致(圖1)。而在未轉染的對照組細胞中，未擴增出403bp特異條帶。在兩組中均擴增出作為內對照的βactin產物561bp條帶。分析結果顯示：大小為42kD的內參βactin蛋白條帶在轉染和未轉染的Y79細胞中均可見，一個大小為59kD的條帶，在轉染了pcChCDTK載體的Y79細胞中可見，這與yCDTK基因序列分析的預期蛋白大小一致，為自殺基因yCDTK蛋白。未轉染pcChCDTK的Y79細胞中則沒有59kD的條帶出現(圖2)。
2.2 Y79細胞轉染后5
FC轉化效率 加5FC 24h后上清中5FU的濃度平均含量為169mg/L，5FC向5FU的轉化效率約為84.5%。
2.3前體藥物對Y79細胞的毒性
將生長良好的人視網膜母細胞瘤Y79細胞，按每孔2×105個細胞接種到96孔板中培養。加入不同濃度的前體藥物5FC培養5d，平均細胞存活率分別為98.2%，94.7%，90.5%，88.2%，89.4%，86.4%和83.9%。SNK檢驗表明，各梯度間的細胞存活率存在顯著性差異(P
2.4前體藥物對用腫瘤殺傷載體轉染的人視網膜母細胞瘤細胞的毒性檢測
將電轉了pcChCDTK的人視網膜母細胞瘤細胞，按相同的密度將細胞接種到96孔板中培養。加入不同濃度的前體藥物5FC培養5d，平均細胞存活率分別為94.0%，91.6%，85.1%，80.0%，72.7%，69.9%和62.7%。SNK檢驗表明，各梯度間的細胞存活率存在顯著性差異(P
3討論
目前，相對于傳統的視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)治療方法而言，RB基因治療不僅可以彌補光凝固治療、光動力學治療、溫熱治療、冷凍治療的應用局限性，而且不會產生諸如化學治療、放射治療的副作用，更不會因為眼球摘除所導致的致殘性而造成患兒心理障礙影響生圖1RTPCR產物凝膠電泳圖 M:DL2000 Marker;1:轉染組可見預期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未轉染組;3:陰性對照。圖2Western Blot檢測CDTK的表達 A：1，2:βactin(42kD);B：1:轉染pcChCDTK的Y79細胞，出現一條約59kD蛋白;2:未轉染的Y79細胞。
存質量。因此，RB基因治療的研究越來越為人們所重視，并且通過不同的治療策略取得了一系列的研究進展。現階段對RB基因治療的研究主要集中在4種不同的基因上，包括自殺基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB發生的分子機制還不是太清楚，而且與RB形成相關的抑癌基因凋亡誘導基因種類繁多，與腫瘤血管形成相關的誘導因子和抑制因子多種多樣，且分子機制仍有待于進一步研究。我們選擇雙自殺基因CDTK作為目的基因，實施RB的自殺基因治療。首先，自殺基因作為腫瘤基因治療的候選基因，已經在多種腫瘤開展研究[27]。其表達產物和前體藥物相互作用來實現腫瘤基因治療的機制比較清楚。其次，自殺基因和前體藥物相互作用產生的毒性物質能通過不同方式實現對鄰近腫瘤細胞的旁殺效應，包括直接分泌到細胞外旁殺，或通過細胞間隙連接旁殺，或通過產生凋亡小體、免疫介導來實現旁殺。同時，目前的研究表明，自殺基因系統治療RB是安全有效的[8]。我們設計的含有雙自殺基因CDTK的載體通過電轉染的方式導入了視網膜母細胞瘤細胞株Y79細胞。48h后，提取轉染Y79細胞RNA，RTPCR的結果可見一403bp特異條帶，與預期大小一致，顯示雙自殺基因CDTK在細胞中mRNA水平得到了表達。Western blot的結果也同樣顯示，載體轉染的Y79細胞中，59kD的目的基因蛋白有明顯的表達。這兩個實驗結果充分說明，我們構建的雙自殺基因CDTK在靶細胞Y79中得到表達。先前的研究顯示，被設計得的融合基因yCD/UPRT、大腸桿菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最強的催化前體藥物向細胞毒物轉化的能力。我們通過HPLC檢測5FU的濃度，上清中5FU的濃度平均含量為169mg/L，故5FC向5FU的轉化效率約為84.5%，說明我們所構建的腫瘤特異性雙自殺基因載體具有很強的催化前體藥物向細胞毒性物質轉化的能力。
雙自殺基因療法是將兩種自殺基因整合在一起，通過載體轉導進入腫瘤細胞，其在腫瘤細胞內表達的融合基因產物具備兩種酶的活性。因此，雙自殺基因療法可以大大提高抑制腫瘤生長的功效，同時使得前體藥物的用量減半。大量資料表明雙前體藥物對腫瘤細胞的殺傷作用要強于單前體藥物。但也有資料顯示雙自殺基因之間可能存在拮抗效應。在體外實驗中，單獨加5FC的細胞殺傷最強，要高于5FC和GCV都加的組，而單獨加GCV的細胞殺傷力最低， CD和TK之間沒有協同作用，反而可能會相互干擾各自功能的運行。原因可能有兩個方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同時加5FC和GCV時，CD/5FC和TK/GCV兩種系統的功能出現拮抗效應;(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某種原因，CD和TK的活性在這個融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV兩種系統的抑瘤能力同時或其中一種得到增強。當E.coli CD和HSV1 TK基因同時在一種細胞中表達時，會存在相互干擾作用。這種干擾作用的機制到目前還沒搞清楚，但干擾作用可能不是發生在基因的轉錄期，而是在轉錄之后，TK介導的5FUMP的磷酸化會產生無毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性產物5FUDP和5FUTP，從而減低了CD/5FC的細胞毒性作用;或者CD介導的對GCV，ACV等的脫胺反應減低了TK/GCV系統的細胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性與單獨的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于單獨CD酶活性100倍。這種酶活性的改變可能與這3種酶的蛋白質特性不同有關。加入不同濃度的前體藥物5FC，GCV或5FC+GCV于電轉了pcChCDTK的人視網膜母細胞瘤Y79細胞培養5d， SNK檢驗表明，與未轉染的細胞對應濃度組比較，當5FC濃度達到100mg/L后各對應濃度平均細胞存活率組間均存在差異(PGCV >5FC。在本實驗中，單前體藥物對雙自殺基因CDTK載體轉染的Y79細胞均有殺傷作用，但雙前體藥物的殺傷作用要強于單前體藥物。分析產生這種結果的原因，我們認為：(1)雙自殺基因載體具有很強的催化前體藥物向細胞毒物轉化的能力;(2)這可能與我們加入的CMV增強子能大大促進hTERT啟動子啟動下游目的基因的表達有關，因為CMV增強子具有強大的增強轉錄能力，且沒有組織特異性。
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【關鍵詞】 肝癌；腺病毒； p53；基因治療
〔Abstract〕 Objective To explore the potential use of adenovirus mediated p53 gene (Ad-p53) therapy for hepatocellular carcinoma.
Methods A human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was used. Recombinant adenovirus carrying wild-type p53 gene was transfected into HepG2 cells in vitro and injected into tumor nodules in vivo. The growth of HepG2 cells in vitro and established hepatocellular carcinoma nodules in nude mice was examined. Cell apoptosis was analysed by Annexin-V/PI labeling flow cytometry method.
Results
Cell growth was greatly suppressed at ≥ 125MOI. p53 transfection can increase HepG2 cells apoposis rate. In vivo studies， intratumoral injection of Ad-p53 significantly inhibited hepatocellular carcinoma implanted xenograft.
Conclusion
Transfection of wild-type p53 gene via Ad-p53 is a potential approach to the therapy of hepatocellular carcinoma.
〔Key Words〕
Kepatocellular carcinoma; Adenovirus; p53; Gene therapy
原發肝細胞性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，因其惡性程度高、預后差，目前臨床采用的多種傳統治療手段都不能收到滿意的效果。p53 基因在肝癌細胞中的突變率達 50% 以上[1]，是肝癌細胞中突變頻率最高的基因，因此成為肝癌基因治療的最佳靶點之一。腺病毒 DNA 不整合到宿主細胞基因組中，對人體無遺傳毒性，作為基因載體既可感染處于分裂狀態的細胞，也可感染靜息期細胞。本研究旨在探討重組人 p53 腺病毒（Ad-p53）對人肝癌 HepG2 細胞的抑制作用，現報道如下。
1
材料與方法
1.1
材料
重組腺病毒介導 p53 基因（Ad-p53）由深圳市賽百諾基因技術有限公司提供，對照病毒 Ad-LacZ 由中山大學醫學院伍莊博士惠贈。人肝癌細胞株 HepG2（內源性表達野生型 p53）由中山大學醫學院伍莊博士惠贈，細胞在 RPMI-1640 培養基傳代培養。5~7 周齡 BALB/c 裸鼠，雌性，體重 18~21 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于無菌塑料透明隔離器內，動物實驗時嚴格無菌操作。
1.2
MTT 法檢測病毒感染滴度與細胞存活的關系
將 HepG2 細胞按每孔 500 個細胞分別接種于 96 孔板內，第 2 天用 Ad-p53 分別以 10、25、50、75、100、125、150 效靶比（multiplicity of infection， MOI）感染細胞，對照組不加藥，每一 MOI 值重復 6 孔。37℃，5% CO2 飽和濕度培養箱中培養 10 h 后棄去病毒感染液，換新鮮培養液，每孔加入 50 g MTT，孵育 4 h 后二甲基亞砜（DMSO）終止反應，酶標儀測定光吸收度。
1.3
MTT 法檢測病毒感染時間與細胞存活的關系
將 HepG2 細胞按每孔 500 個細胞分別接種于 96 孔板內，第 2 天用 Ad-p53 以 125 MOI 感染細胞，對照組不加藥，每一時間值重復 6 孔。37℃，5% CO2 飽和濕度培養箱中分別培養 30、60、90、120、150 min 后棄去病毒感染液，換新鮮培養液，24 h 后換新鮮培養液，每孔加入 50 g MTT，孵育 4 h 后 DMSO 終止反應，酶標儀測定光吸收度。
1.4
臺盼藍染色繪制細胞生長曲線
將 HepG2 細胞 1×105 接種于 60 mm 的平皿，培養到約 70% 匯合，細胞計數，吸出培養液，125 MOI 值的 Ad-p53 和空載體腺病毒 Ad-LacZ 感染 HepG2 細胞，設空白對照，每天觀察細胞生長狀況，于感染的 2、4、6、8 d，用 2.5 g/L 胰蛋酶消化細胞，離心收集細胞，臺盼藍染色，細胞計數，每皿重復 3 次，取平均值，繪制細胞生長曲線。
1.5
Annexin V/PI 雙染色法檢測細胞凋亡
分別取 5×105 個對數生長期 HepG2 接種于 6 孔板， 125 MOI 值的 Ad-p53、Ad-LacZ 及 PBS 作用 24 h 后收獲細胞，每個標本加入 Annexin V 2 L、PI 熒光抗體 2 L，室溫避光雙染色 15 min，加入 400 L 結合緩沖液，上流式細胞儀檢測分析，獲得標記陽性的細胞，計算細胞凋亡率。
1.6
Ad-p53 對裸鼠移植瘤生長的抑制作用
HepG2 細胞在 37℃，5% CO2，含 10% 小牛血清的 RPMI-1640 的培養基中培養，將處于對數生長期的細胞用 0.25% 胰蛋白酶消化，用無菌 PBS 液重懸制成 5×107/mL 的單細胞懸液，每只裸小鼠于右側后肢外側皮下接種 0.2 mL (1×107)細胞懸液，共 18 只。接種 6 d 后，將荷瘤裸鼠隨機分為 3 組，每組 6 只，于腫瘤結節（或腫瘤接種部位）內分別注射 0.1 mL 的 PBS 液或含有 5×107 pfu 的 Ad-LacZ、Ad-p53。每隔 3 d 注射 1 次，共注射 5 次，每次注射前測量腫瘤體積。游標卡尺測量腫瘤結節的長度（a）和寬度（b），按公式 V=ab2/2 計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。
1.7
統計學處理
實驗結果以 x±s 表示，采用SPSS 10.0 統計軟件進行配對 t 檢驗。
2
結
果
2.1
病毒感染滴度與細胞存活的關系
與空白對照相比，Ad-p53 對 HepG2 細胞有明顯抑制作用，隨著 MOI 的增加，野生型 p53（wild type- p53，wt-p53）對細胞的抑制作用逐漸增強，當病毒量為 125 MOI 時，HepG2 細胞基本達到完全抑制（圖 1）。
2.2
MTT 法檢測病毒感染時間與細胞存活的關系
Ad-p53 對 HepG2 細胞的抑制作用與病毒感染時間有關，隨著感染時間的延長，wt-p53 對細胞的抑制作用逐漸增強。當感染時間達到 120 min 時，HepG2 細胞基本達到完全抑制（圖 2）。
2. 3
Ad-p53 對肝癌細胞生長抑制的檢測
125 MOI 值的空載體腺病毒 Ad2LacZ 對 HepG2 細胞的生長影響與對照組相比沒有差別，而以 125 MOI 值的 Ad-p53 感染 HepG2 細胞能對細胞生長產生明顯抑制（P < 0.01，圖 3）。這一結果表明，對腫瘤細胞的抑制作用來自轉導的野生型 p53cDNA，而不是缺陷腺病毒載體本身。
2.4
Annexin V/PI 雙染色法檢測細胞早期凋亡
125 MOI 值的 Ad-p53、Ad-LacZ 及 PBS 作用于 HepG2 細胞 24 h 后，細胞早期凋亡率（Annexin V+/PI-）和細胞總凋亡率（Annexin V+/PI-與 Annexin V+/PI+之和）結果見表 1。
2.5
Ad-p53 對裸鼠移植瘤生長的抑制作用
所有 18 只裸鼠均成活，3 組裸鼠給藥前體重和腫瘤體積經統計學分析組間均無顯著性差異（P > 0.05），表明各組裸鼠體重和腫瘤體積在治療前均衡性好。在細胞懸液接種后的第 6 天，各個接種點均可見實體腫瘤結節，直徑 0.4~0.6 cm。裸鼠荷瘤瘤體內注射PBS 和 Ad-LacZ 后，體積仍持續增大；相反，注射Ad-p53 后腫瘤的生長即受到十分明顯的抑制（圖 4）。當實驗結束時，與 PBS 注射組相比，Ad-LacZ 組腫瘤體積并未見顯著降低（P > 0.05），而 Ad-p53 組的腫瘤生長幅度均受到明顯的抑制，平均體積較PBS 組（P < 0.01）和 Ad-LacZ 組（P < 0.01）顯著降低。
轉貼于
3
討
論
p53 基因是正常細胞內關鍵的看家基因，是最重要的一個抑癌基因。其通過以下作用實現抑癌作用：①細胞周期阻滯、促進損傷細胞修復[2]；②誘導嚴重受損細胞凋亡[3]；③調節機體免疫反應；④抑制生存增殖信號途徑[4]；⑤ 抑制血管生成及物質能量代謝；⑥ 抑制細胞-細胞黏附及其浸潤轉移。p53 基因異常而失去上述抗細胞增殖、促凋亡功能時細胞極易發生異常增生和癌變。可引起 DNA 損傷的放射線、化學劑和熱，都產生細胞周期阻滯和誘導凋亡，正常功能的野生型 p53 基因即促進這些效應，p53 基因缺失或變異即減弱甚至破壞了這些效應。人類腫瘤的 50% 以上都存在 p53 變異而功能失常，從而降低了治療的療效。抑癌基因治療是將正常的腫瘤抑制基因導入腫瘤細胞可代替和補償缺陷的基因，以抑制腫瘤的生長，這是從根本攻克腫瘤的關鍵環節。p53 基因是與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因，是腫瘤基因治療的重要靶點之一，通過導入野生型 p53 來重建細胞內變異的 p53 已成為腫瘤治療的新策略，是當前研究的熱點。實驗證實，野生型p53 的導入對多類腫瘤產生明顯的抑制作用[5-7]。
本實驗觀察到以腺病毒為載體的 wt-p53 導入對肝癌細胞生長產生明顯抑制。發現 Ad-p53 的抑制作用與感染濃度及感染時間有關，隨著感染濃度的增高，抑制作用逐漸增強，當 Ad-p53 對癌細胞在感染濃度 100 MOI 時能基本達到完全抑制。Ad-p53 感染時間越長，抑制作用越明顯，當感染時間達到 120 min 時，HepG2 細胞基本達到完全抑制。通過與重組腺病毒 Ad-LacZ 對照，表明此抑制作用來自野生型p53 基因的表達，而不是重組腺病毒本身。在體外實驗的基礎上，我們觀察了 Ad-p53 對荷瘤裸鼠腫瘤生長的作用，體內實驗顯示經 Ad-p53 注射的腫瘤結節生長受到了明顯的抑制，Ad-p53 實體瘤局部注射是可取的治療方案。國內外在肺癌、頭頸部癌、膠質瘤等腫瘤的Ⅰ或Ⅱ期臨床試驗已初步證明[7-10]，它不僅對一些腫瘤有治療效果，而且未發現有明顯的毒副作用。
本研究結果證實：無論用細胞培養轉染還是種植瘤內注射的方法，都顯示了 Ad-p53 對肝癌細胞的抑制作用，為臨床應用 p53 基因治療肝癌提供了可靠的實驗依據。
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腫瘤是機體中正常細胞在不同始動與促進因素長期作用下,所產生的增生與異常分化形成的新生物。隨著疾病譜的改變，腫瘤已成為目前導致死亡的常見原因之一，隨著現代科學技術的發展和突飛猛進，給科學技術方法研究帶來革命性變化，腫瘤逐漸地被看成為一種全身性疾?S紗碩?，肿刘V瘟乒勰畋惴⑸嗣饗緣淖潁琢鱟酆現瘟葡低徹塾υ碩?。紕撚系蛷刿的角度根舅W∪說幕遄純霾±聿∑謨敕⒄骨魘?有計劃地、合理地綜合應用現有的各種治療手段,以期較大幅度地提高病人的生存率,改善病人的生存質量。
1腫瘤發生、發展的系統觀
所謂系統是指若干要素按一定的結構相互聯系組成具有特定的功能的有機整體，而這個整體本身又是它所從屬的一個更大系統的一個組成部分。系統科學的觀點，就是要求把研究對象視為系統，把事物的普遍聯系和永恒運動看成一個整體過程，全面的把握和控制，綜合的探索系統中要素與要素、要素與系統、系統與環境、系統與系統的相互作用和變化規律，把握住對象的內環境與外環境的關系，以便有效地認識和改造對象［1］。任何系統都是開放的系統，每一個系統的存在都有整體性、層次性及動態平衡性等基本特征。一個生物學意義上的人，也完全可以看成是一個開放系統。這一系統本身就由各個子系統（循環、呼吸、消化等系統）組成，各系統之間并非獨立存在，有相互影響、相互制約的作用關系，這一大系統和外界進行不斷的物質和能量的交換，借以維持自身的穩態，達到功能的最優化，即生存質量最佳化。所以有學者認為：決定疾病發生發展的，不僅僅在于器官、組織、細胞、基因等各種要素的性能，更重要的是要素和要素之間，系統和環境之間的相互聯系和作用，考察疾病的本質，必須把注意和焦點放在相互聯系和相互作用上［2］。上述說法就是從系統水平進行考察，而不同局限于單個細胞或基因的功能行為。那么，在腫瘤的發生學上，是否肯定“基因決定論”的觀點呢？近幾年的研究提出，細胞基因的缺失、突變等導致的細胞生長失控、惡變是發生腫瘤的主要機制。從分子水平看，腫瘤的病因主要有癌基因的激活和抑癌基因的失活，細胞周期調控基因的改變，前者是發病的基礎，并通過后者發揮作用。但對于這么一個子系統（核酸系統）的考察，并不能完全解釋腫瘤的發生。核酸系統之間，核酸與蛋白質系統之間，核酸與神經-內分泌系統之間，核酸與內、外環境之間均存在著千絲萬縷的聯系。癌基因的激活和抑癌基因的失活并不會無緣無故發生，研究已表明，腫瘤的發生和發展是一個多基因、多步驟、多因素的漸進過程。環境污染致癌因素的刺激，化學致癌因素如苯、氯霉素、亞硝酸胺的影響，物理致癌因素，腫瘤的病毒病因，其他如人體內分泌失調、遺傳、慢性刺激和創傷均可致瘤。而且單因基因突變而產生的腫瘤細胞也未必能發展成腫瘤，在人體這樣一個復雜的系統中，神經-內分泌-免疫等內環境隨時進行警惕的監視，只有整個大系統紊亂，監視功能障礙，腫瘤細胞才能逃脫系統監視，才能進一步發展。而真正發展到器官的癌變，往往要經歷數年甚至幾十年的時間，因為一旦系統的功能恢復正常，腫瘤細胞可被機體清除，只有在內外環境的反復作用下，機體各系統功能的紊亂無法再協調一致，才使得腫瘤得以發展甚至轉移。綜上所述，腫瘤的發生和發展并非“基因決定論”可以完全解決，相反的，只有從系統的整體的水平去考察外界環境和機體的作用，機體自身各個子系統的相互作用，每個子系統內部各要素的相互關系，才能很好地認識其病因和發病機制。
2系統方法論原則對腫瘤治療的思路指導
進入20世紀之后，醫學漸漸進入理性階段。隨著對腫瘤本質認識的不斷深入，更由于腫瘤局部治療方法的停滯不前，局部治療后預后不佳，使更多的學者意識到局部治療的弊端。20世紀80年代，惡性腫瘤的治療方式有手術、放療、化療、生物治療，其中以根治性手術為主，對失去手術機會的中晚期惡性腫瘤只通過單一的放療或化療來延長生存期，有效率低，易于復發，治療手段單一。80年代后期，由于化療藥物的不斷推陳出新，腫瘤學理論的不斷完善，化療的地位日益被重視，發展了誘導化療、術后化療、放化療、熱化療等各種綜合治療模式，手術方式也由根治性手術向保守性手術、保留器官功能方向發展，因此，21世紀的腫瘤治療更注重強調根據病人的身體狀況、腫瘤的病理類型、侵犯范圍（病期）和發展趨向，有計劃合理地應用現有的治療手段，以期較大幅度的提高治愈率，改善病人的生活質量，腫瘤治療觀念由此發生了根本性的轉變，腫瘤綜合治療應運而生［3］。所謂腫瘤綜合治療是指：根據病人的機體狀況，腫瘤的病理類型，侵犯范圍（病期）和發展趨勢，有計劃地、合理地應用現有的治療手段，制定個體化治療方案，以期大幅度地提高治愈率，改善病人的生存質量［4］?？梢哉f，腫瘤治療學研究顯示出多學科的合作與補充，腫瘤的治療也已進入綜合治療的時代。按照系統論整體性原理來講即系統論中各組分相加的和大于各組分的代數和。惡性腫瘤綜合治療個體化的決策，將手術、化療、放療、中醫中藥治療及生物基因治療，依照不同病例特點，進行有機組合，以期達到最佳的治療效果［5］。但它不是將各種治療手段的簡單疊加或隨意輪番應用，孰先孰后，孰輕孰重，均要因人而異，要經過多學科的充分討論協商后決定。在決策過程中，既要注意盡量避免盲目一味強調某一學科在腫瘤治療中的重要性和單一治療方法在腫瘤治療中的過分擴大應用，又要注意各個學科之間的密切合作，相互配合，互補應用，共同來承擔對患者的綜合治療。這就要求無論是哪一個學科的醫生，都要做到不僅能夠了解自己本學科治療手段的特點和不足，還要了解其他相關學科治療手段的特點和不足，真正做到心中有數。要能夠善于應用其他相關學科的成果和特長來對自己本學科的治療加以充實、完善和提高。特別是在科學技術迅猛發展和技術更新速度不斷加快的今天，及時了解并掌握專業技術的發展動態和引進先進技術并加以應用與創新，以跟上時代和科技發展的步伐。當前，越來越多的腫瘤病人首診時都選擇到腫瘤內科，主要是因為腫瘤內科的醫生能夠善于接受和利用新的醫學研究成果，以病人利益為重，改變過去誰先接診誰收治的不規范醫療行為，在對腫瘤病人的診斷以及設計和規劃總體治療策略上起到了主導作用，不僅能夠使腫瘤病人真正享受到現代腫瘤綜合治療模式與治療方案個體化所帶來的益處，而且也充分體現了社會的文明進步與人文關懷［6～13］。我們在臨床工作中必須要按照醫學倫理學“醫乃仁術”和“循證醫學”，謹慎、準確和明智地應用當前所能獲得的最好的研究證據，結合個人的專業技能和多年的臨床經驗，考慮病人的經濟承受能力和意愿，并將此結合最優化的原則來作出具體的治療決策。例如目前放化療綜合治療的臨床應用多集中于頭頸部癌、食管癌、乳腺癌以及肺癌中，通過放化療綜合治療所獲得的較高的局控率和較晚發生遠處轉移，為我們提供了一條中晚期惡性腫瘤治療的新途徑。靜脈化療起到了全身治療的目的－在于徹底清除微小轉移灶，放療作為一種局部治療，二者聯合應用的優點不言而喻，中晚期惡性腫瘤傳統的單一治療模式已遠遠不能適應目前臨床要求，放化療綜合治療不僅提高生存率，對延緩發生遠處轉移也顯示出了不可比擬的優越性，尤其是同期放化療的應用將中晚期惡性腫瘤的治療帶上一個新的臺階［14］。
隨著分子生物學技術的發展，作為生物醫學前沿的人類基因組計劃研究步入實質性階段，基因治療腫瘤成為熱門。基因治療能否給人類帶來巨大的革命，已成為現代醫學大家的研究方向。所謂基因治療是指把目的基因導入靶細胞和宿主體內，通過基因組合，成為宿主遺傳物質的一部分，糾正錯誤的基因表達和基因表達的錯誤，以達到治療的目的［15］。通常包括四方面的內容：基因修正-糾正缺陷基因的突變堿基序列；基因置換-由正?；驌Q掉疾病基因；基因修飾-將目的基因導入病變細胞的基因，其表達產物用以修飾缺陷基因導致的細胞功能異常，或使正常功能得以加強；基因失活-應用反義技術封閉不該表達的基因，以抑制有害基因，或直接抑制有害基因的表達。雖然就基因治療的概念來說，體現的是分子水平的基本理論和原則，但其治療的目的是為了抑制腫瘤的生長或達到逆轉、殺死腫瘤細胞，所以在治療過程中仍需考慮所作用的個體系統，如外界的環境因素，機體的內環境和免疫功能的影響等。因為將基因導入細胞，使正?；虻靡员磉_，或使病變基因不表達，或誘導已有的腫瘤細胞分化、凋亡，都不是單單一個分子水平可以解決的。例如將反義基因導入細胞，以封閉有害基因的表達，在體外實驗中，所要觀察的指標限于細胞水平，如基因轉染的百分率，對腫瘤細胞生長和抑制率等。但一旦進入體內實驗階段，就不能不考慮機體的整體性，如反義核苷酸對腫瘤細胞有抑制作用，那么對正常細胞或組織器官是否有毒性作用呢？在體內，在各種調節機制的作用下或各種核酸酶等水解酶的作用下，反義核苷酸是否能成功地進入細胞封閉有害基因呢？再如用逆轉錄病毒載體介導的基因轉移有效性高并容易獲得穩定表達，但這一插入突變是否會引起潛在的癌基因激活，從而又引發新的腫瘤呢？顯然，在腫瘤的基因治療的研究中，在體外細胞水平中有良好的效應，但進入機體系統中，其效果不一定良好，而且歷史上也有基因治療失敗的例子。這正是因為人體是一個復雜的系統，各個子系統之間有復雜的相互關系，而腫瘤的發生和發展也并非由基因單獨決定，如果單從基因這一方面去考慮，而忽略了治療所處的整體環境，忽略了治療應采取的整體措施，往往會導致實驗的失敗。任何對腫瘤疾病的治療方法需經過人體內試驗，要從系統和整體的水平觀察治療有效性和可能存在的副作用，腫瘤基因治療也需遵循系統觀點，用整體性、動態性、聯系性的原理，達到最佳的預期效果。但在實際工作中，尚有許多疑難問題，對于這些問題解決離不開系統科學觀的支持，我們不能忽視機體的整體性，不能用局限、部分、分子細胞水平來以偏概全，只有用系統的環境中解決這些難題，才會有實用價值和臨床價值。所以從腫瘤的綜合治療可以看出，綜合手術、化療、放療及生物基因治療、中醫中藥治療、內分泌治療等手段，依據具體情況具體分析的原則，針對具體的病例，制訂相應的個性化的治療方案，最終達到最佳綜合療效，在某些領域已顯示了令人鼓舞的前景。隨著人類基因組計劃的完成，人類表觀基因組協會（humnanepigenomeconsortium,HEC）在2003年10月正式宣布開始實施人類表觀基因組計劃（humanepigenomeproiect,HEP），通過大規模檢測人類基因組,基因組學研究進入一個新的階段,也為解開生命奧秘及征服腫瘤等疾病帶來了希望［16］。人類攻克癌癥近在咫尺，但仍有很長的路要走，尚有不少難題有待在今后實踐中予研究解決。讓我們記住著名的系統科學家拉茲洛教授的話：“今天我們正目睹一場思維方式的轉化：轉向嚴謹精細而又整體的理論。這就是說：要構成擁有它們自己的性質和關系集成的集合體，按照同整體聯系在一起的事實和事件來思考。”［17］。
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中圖分類號：R273文獻標識碼：A
文章編號：1007-2349（2011）11-0085-03
非小細胞型肺癌（nonsmallcelllungcancer，簡稱NSCLC），是發生于肺部的常見癌癥。根據病理學組織結構，可分為鱗癌、腺癌、大細胞癌等不同類型，約占肺癌總數的80~85%[1]。目前治療以西醫治療為主，其中以手術治療、放療、化療為主要治療手段。中醫作為輔助療法不但可減輕放、化療所致的毒副作用，而且有利于放、化療順利進行，在延長生存期等方面取得了較為滿意的療效。從總體治療效果看，NSCLC的臨床治療已取得很大進展。本文就NSCLC的臨床中西醫治療進展與展望作一綜述。
1外科治療
11一般手術治療一般手術治療仍然是目前治療早期非小細胞肺癌最理想的方法。手術方法有肺葉切除、一側全肺切除、袖式肺葉切除、氣管隆凸再造、氣管-肺動脈成形術等手術方法。同時需高度重視淋巴結清掃，只有通過系統肺門和縱隔淋巴結清掃才能達到完全切除和標準分期的目的。
12微創胸外科手術治療目前，肺癌微創外科技術主要有3種手術方式，即視頻輔助胸腔鏡手術（video-assistedthoracoscopicsurgery，VATS）、機器人輔助胸腔鏡手術（robot-assistedthoracoscopicsurgery，RATS）和保護胸壁肌肉的小切口開胸手術（muscle-sparingminithoracotomy，MSMT）。（1）VATS：目前中國多家胸外科中心已開展VATS肺癌切除術，在2008年第8次全國胸心血管外科學術會議上，華西醫院劉倫旭介紹了更具有操作性、更加規范的“單向式胸腔鏡肺葉切除術”，標志著中國VATS肺癌切除術的成熟。（2）RATS：近年，機器人已被引入外科手術中，這揭示了未來胸外科的發展趨勢和方向[2]。2006年美國紐約紀念醫院[3]報告了34例RATS肺葉切除的臨床資料，無手術死亡，4例（12%）中轉開胸，平均清除4組淋巴結，中位手術時間218min，中位胸腔引流時間3d，中位住院時間45d。（3）MSMT：隨著器械外科技術的進步和小切口下手術操作技巧的提高，經MSMT可方便地施行與傳統開胸手術相同的解剖性肺切除和系統淋巴結清掃，已能對絕大多數具備手術適應證的肺癌實施根治性切除，獲得與傳統后外側切口肺癌切除術相同的治療結果。
2化療
目前化療方案大致可分為兩類：以鉑類藥物為基礎的雙藥聯合方案和不含鉑類藥物的方案。（1）以鉑類藥物為基礎的雙藥聯合方案是目前治療NSCLC較常用的一種手段，藥物的組合方式也有多種，鉑類聯合新藥是目前治療的首選方案[4]。對于有良好預后因素的晚期NSCLC患者采用聯合順鉑與健澤、紫杉醇、異長春花堿化療取得了令人滿意的有效率；對于沒有良好預后因素或老年患者，采用異長春花堿、健澤或紫杉醇單藥治療更為合適[5]。（2）不含鉑類藥物的方案藥物主要是紫杉醇、多西他賽、泰素帝、吉西他濱等。目前最引人注目的方法是“TXT”（泰索帝）75mg/m2（毫克每平方米體表面積）單一藥物治療[6]。
3放療
根據目前的研究，放療可分為術前放療、術中放療和術后放療3種方法。術前放療的目的為清除手術區域以外的亞臨床病變，減小腫瘤體積以及相鄰組織之間的浸潤，減少局部種植和轉移的機會，以提高切除率和生存率。但是臨床實踐顯示上述目的未能達到，并沒有使患者受益，臨床上已不常規采用[7]。術中放療的目的是降低局部復發率，是近年發展的在手術殘留部位以電子線進行的一次性大劑量（15gy～25gy）照射，手術傷口愈合后再行體外高能放療。術后放射治療可提高生存率，對于手術中癌腫組織未能全部切除或支氣管斷端殘留癌浸潤的病例可放置金屬標記行放療。
4分子靶向治療
分子靶向治療比傳統的化療具有更高的選擇性，毒副作用小，是今后腫瘤治療的新趨勢[8]。目前臨床應用的分子靶向治療藥物主要有以下3類：（1）作用于表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑是一種跨膜蛋白，為原癌基因EerB1（Her21）的表達物。這類藥物包括易瑞沙和埃羅替尼等多種藥物。（2）作用于血管生成的靶向藥物是一種重組人源化抗血管內皮生長因子單克隆抗體，由培養在含慶大霉素培養基中的中國倉鼠卵巢哺乳細胞表達體系生產。這類藥物主要有貝伐單抗等。（3）多靶點治療藥物是一種口服多靶點治療藥物，能選擇性地抑制血管內皮生長因子依賴的腫瘤血管形成，而且對表皮生長因子受體也有一定抑制作用。這類藥物有ZD6474等。
5免疫治療
51主動免疫療法主要有非特異性主動免疫療法和特異性主動免疫療法。（1）非特異性主動免疫療法：目前主要應用具有免疫調節作用的刺激因子通過非特異性的作用激發機體的免疫系統，增強抗腫瘤的免疫應答。如卡介苗、短小棒狀桿菌、左旋咪唑等，也可用細胞因子如白介素-2、白介素-4、干擾素、腫瘤壞死因子等。但由于肺癌的腫瘤抗原性不強，目前這種治療難以取得明顯效果。（2）特異性主動免疫療法：隨著對腫瘤免疫研究的深入，腫瘤疫苗和抗獨特性抗體作為疫苗的發現使特異性主動免疫療法成為可能[9]。某些抗獨特性抗體與抗體上的抗原相關位點結合，能夠模擬外來抗原，作為免疫治療中替代性抗原。
52被動免疫療法主要有過繼免疫療法和抗體療法。（1）過繼免疫療法：目前肺癌的過繼免疫療法可以應用淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）輸入體內或局部應用于癌性胸水，對延緩病情的發展有一定的效果，但單獨應用治療效果不佳。還可以應用腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL），通過基因修飾的TIL進行治療。實踐證明TIL的療效比LAK要更好。（2）抗體療法：目前抗體療法正成為肺癌的另一研究熱點，它已成為肺癌綜合治療的一部分。運用相應的單克隆抗體與異常表達的癌基因產物結合可以阻斷癌細胞的異常信號傳導通路，從而阻止癌癥的發展[10]。
6介入治療
目前介入治療在NSCLC應用的方法主要有兩種，即經支氣管動脈灌注化療和支氣管栓塞治療。經支氣管動脈灌注化療可有效提高腫瘤局部藥物濃度，提高抗癌藥物的解毒作用，同時又可以減少或阻斷腫瘤的血供，使其縮小、壞死。支氣管栓塞治療可通過介入放支架解除腫瘤引起的中心氣道狹窄或阻塞，對繼發于肺癌的上腔靜脈綜合征患者血管內置人支架是較好的方法。
7基因治療
基因治療在該病所應用的方法主要有[11]誘導特異性免疫的基因治療和直接作用的基因治療兩種。誘導特異性免疫的基因治療即輸送生物活性基因來改變癌細胞的局部免疫環境，增加癌細胞的免疫原性和T細胞的反應性，改善抗原提呈和提供缺失的旁分泌。由于免疫性誘導是遺傳性系統性的，同時靶子來源于腫瘤抗原，因此所誘導的免疫性具有潛在發現和殺死沒有經過基因修改的腫瘤細胞。這一特點可能對以遠處轉移為主要問題的肺癌具有重要意義。直接作用的基因治療主要有抑癌基因的治療、藥敏感性基因治療和反義cDNA和寡核苷酸技術3種方法。
8中醫藥治療
中醫學側重辨證施治，從整體調節入手，目前中醫藥在治療肺癌中，特別是在NSCLC的防治方面主要有以下作用：（1）防治手術、放療、化療副反應；（2）配合手術、放療、化療減毒增效；（3）在抗非小細胞肺癌復發和轉移的綜合治療中起很重要的作用；（4）不能手術、放療，不宜再化療的肺癌患者，中醫起主導作用，即改善癥狀、提高生存質量、延長生存期[12]。
81病因病機中醫學認為，肺癌屬“肺積”“痞癖”“咳嗽”“咯血”“胸痛”等范疇，病位在肺。學者們對其病因病機雖然有不同的認識，但無外乎正氣虛損和邪毒內積兩個方面，本病病變部位在肺，與脾、腎有關，病理因素主要為氣滯、痰濁、瘀血、熱毒，病理性質為本虛標實，虛實錯雜。在治療過程中，扶正培本為其關鍵。
劉麗坤等[13]認為，肺癌的基本病機為正虛邪實。正虛是肺癌發生的基礎，是復發、轉移的關鍵，其中肺陰虧虛貫穿疾病的始終，痰瘀毒結是肺癌的主要病理表現。劉嘉湘認為肺癌總屬本虛標實，由于正氣先傷，邪氣得以乘虛而入，聚積于肺，導致氣滯血瘀、聚液為痰、痰瘀交阻而漸成腫塊。高萍等認為放化療副反應是毒邪內侵，損害肝脾腎等臟腑功能，耗傷機體氣血津液，導致氣血陰陽的失調與缺失。
82辨證分型中醫將肺癌看作是全身性疾病的一個局部表現，主要根據癥狀和體征對肺癌進行辨證分型，治療上強調全面調整人體機能。目前主要依據陰陽盛衰、氣血的虛實、臟腑病機以及邪毒性質進行歸類分型。這些證型基本反映了肺癌病情發展不同階段的一些規律。劉嘉湘對405例非小細胞肺癌病例進行研究，其中陰虛和氣陰兩虛型占肺癌的726%，指出肺癌的病機特點以陰虛和氣陰兩虛為主。楊國旺等將肺癌劃分為氣虛、陰虛、陽虛、血虛、痰濕、血瘀、毒熱7個基本證型。李忠等研究發現以氣陰兩虛及痰瘀互阻證型最為常見，其他依次為脾虛痰濕、肺脾氣虛、氣虛血瘀、痰濕阻滯等。孫士玲分為肺脾氣虛、肺，胃陰虛、肺熱痰濕、氣滯血瘀型。
83中成藥中醫藥作為一個輔助療法，在非小細胞肺癌的治療中起到了很大的作用。隨著中藥制劑現代化研究，研制成了很多中成藥，有很好的臨床療效。目前臨床上使用的口服中成藥有固本消瘤膠囊、乾坤膠囊、平消膠囊、抗瘤沖劑、仙露沖劑、中成藥鶴蟾片、參一膠囊等。治療NSCLC的中藥靜脈制劑主要有康萊特注射液、參麥注射液、丹參注射液、艾迪注射液、華蟾素、欖香烯、巖舒注射液等。
9回顧與展望
非小細胞肺癌的手術、放療、化療和生物治療等在臨床治療上已經取得了很大的進步，但是治療效果仍不能令人滿意。中醫藥作為一個補充治療手段和方法正起到越來越重要的作用。中醫的整體觀從大局出發，提倡提高機體正氣抗邪，防止病情進展，正彌補了西醫重局部的不足。中醫藥治療肺癌的療效以病灶穩定率較高、生存期較長、改善生活質量較好為主要特點，在抗復發轉移，減負增效方面有一定的優勢，對于已無放化療機會晚期肺癌患者，中醫藥治療是緩解疾苦的主要手段。但是中醫治療在很多方面還不完善，比如辨證分型缺乏統一的認識，臨床應用個案報道數量較多，缺乏大樣本、多因素的觀察，循證醫學證據并不充分等。
筆者認為目前西醫治療一方面微創手術研究是未來外科手術的發展方向，另一方面靶向治療、免疫治療和基因治療都是肺癌多學科治療中新的研究和應用熱點，日益受到重視，是以后發展的方向。要注意提高藥物療效，降低毒副作用，延長患者（尤其是晚期肺癌患者）的生存期。中醫治療應從扶正祛邪，整體調節入手，應特別重視調補肺臟功能兼顧調整五臟功能。具體來說，整體方面要調理飲食，注意飲食平衡；調理藥物，注意藥物之間的平衡，勿太過不及；調理五臟功能，勿偏盛偏衰。局部方面要注意調整肺臟本身的功能和調整脾胃功能。中醫認為“人以胃氣為本”、“脾胃為后天之本，為氣血生化之源”，脾胃功能好壞對疾病的預防和治療都有很重要的作用，尤其在肺癌的防治中更是具有重要價值。未來該病的治療必將走上一條中西醫互補的道路，因而希望能夠多學科配合、大膽摸索、反復實踐，更好的發揮中西醫結合在NSCLC預防治療中的特色和優勢，從而對人類防治NSCLC整體水平的提高起到積極地推動作用。
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中圖分類號：G642.41 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2015）03-0119-02
基因工程又稱為基因拼接或者DNA重組技術，是將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳并表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序。1972年美國人Berg在基因工程基礎研究方面做出了突出貢獻，被公認為“基因工程之父”。1973年美國人Cohen等用核酸限制性內切酶EcoRI，首次基因重組成功。近些年來，基因工程的新概念、新理論及新技術不斷涌現，內容也在不斷豐富與充實，已廣泛應用于生命科學的各個領域[1，2]。21世紀以來，基因組學已進入功能基因組學時代，對基因功能的研究是生物技術發展的新方向，體現了基因工程的重要價值所在?；蚬こ虒W作為當代生命科學研究領域最具生命力、最引人關注的前沿學科之一，已經發展成為現代分子生物學、技術學的核心內容，其課程質量的好壞直接關系學生的專業素質和創新能力的培養。作者所在學院（浙江海洋學院海洋科學與技術學院）于2007年新增了生物技術專業，同時開設了基因工程課程。為了不斷提高該課程的教學水平，筆者結合這幾年的教學經驗以及兄弟院校相關課程的授課經驗，努力充實教學內容，不斷更新教學手段，對基因工程課程的教學體系進行了探索式改革。
一、教學內容
1.不斷更新教學內容，突出實用性?；蚬こ汤碚撟鳛橐环N專業性很強的課程，需在學生有一定生物學知識的基礎上教學。在浙江海洋學院本課程于大三下學期開課，在此之前學生已修完細胞生物學、分子生物學、遺傳學等生物學基礎課程，具備了較完整的理論知識體系，在此基礎上開展教學，有利于學生對知識的理解和掌握?；蚬こ套鳛橐环N技術性很強的課程，與上述生物學基礎課程關系密切，同時與酶工程、蛋白質工程、細胞工程等學科緊密聯系，存在一定的內容重復。在教學過程中，對于此類重復，或一筆帶過，點到為主，或采用實例對重要知識加以鞏固，盡量避免重復，突出課程特色。教材是提高教學質量的重要環節，浙江海洋學院第一次即2010年選用的《基因工程》教材由高等教育出版社出版，孫明教授主編。該教材內容全面翔實、章節清晰，對基因工程的原理、策略和技術方法均有系統介紹，具有很強的理論性和前瞻性。但是其內容較多，很多內容對于二本院校本科生來講過于深奧、難以理解，學生也反映該教材較難，建議選其他較易理解的教材。結合該院校是二本院校的實際，筆者從2011年開始使用袁鶩洲主編，化學工業出版社出版的《基因工程》，屬普通高等教育規劃教材。本教材為國家精品課程教材，主要介紹了基因工程的基本概念、基本原理、常用基因工程操作技術以及基因工程與功能基因組學相結合的技術應用進展。主要內容包括三大塊。一是基因工程的基本原理與基本技術，包括工具酶和克隆載體。表達載體及常用的基因表達系統，目的基因獲取、制備、擴增、導入與鑒定的各種方法。二是基因工程在功能基因組學研究中的應用，包括基因表達譜的研究技術，全基因組化學誘變、轉座子飽和誘變的技術，基因敲除與基因敲減的技術，GAL4/UAS過表達系統，酵母雙雜交及免疫共沉淀等蛋白質相互作用研究的技術等。三是基因工程在工農業生產中的應用，包括轉基因植物、轉基因動物的制備與應用，基因治療的原理與策略以及基因工程藥物的研制與現狀等。該教材內容清晰易懂，實例舉證充分，且涉及基因工程在實際生產中的應用，在一定程度上可以提高學生的學習興趣。使用該教材3年來，目前感覺學生反映較好，適合該校學生使用。
2.引領學生了解前沿動態?；蚬こ套鳛橐婚T前沿學科，發展速度快，內容日新月異。我們常用教材多側重原理、基礎等理論知識，且更新速度始終落后于基因工程技術本身的發展速度?，F代學生思維活躍，求知欲強。為了充分滿足學生的求知欲和好奇心，在基因工程教學過程中，盡可能地添加一些新成果、新理論和新技術[3]，如：生物能源，基因工程疫苗的開發，基因治療等，并結合自己在國外實驗室所學向同學們展示最新技術與相關研究進展?；蚬こ痰男录夹g多發表于Science、Nature、Cell等頂尖雜志，在教學過程中，對于發表的經典新成果，嘗試讓學生自己閱讀、分段翻譯、小組討論，增加對新知識的了解[3]。一些重要的生命科學論壇，如：生物谷、丁香園、小木蟲等是生命科學領域研究人員交流學習的地方，而知識的碰撞最容易產生科學的火花。因此，鼓勵學生瀏覽這些論壇，并參與討論，增強學習興趣。另外，也鼓勵他們加入相關的QQ群，比如轉基因群、生物信息群，增加同業交流，為自己拓寬理論知識和解決實際技術問題，同時也為今后從事的相關工作打下堅實基礎。
二、教學手段和教學方法多元化
不像動物學、植物學可以直觀地看到實物，基因工程內容抽象，多涉及細胞、分子等微觀內容，且高新技術多，操作流程長，如果僅僅采用文字和語言表述，難以講授明白，學生學起來也比較晦澀難懂[4]。因此，需要運用多種教學方法，使概念、原理講得通俗易懂，學生理解起來就更容易。
1.多媒體教學的應用。目前，大部分高校已廣泛采用多媒體教學。在基因工程多媒體教學過程中，改變原來單純的文字、圖片等內容，不斷嘗試加入一些聲音、錄像、動畫等信息，使課堂圖文并茂、有聲有色、栩栩如生，便于學生理解并強化記憶。如在講解“PCR反應”一節中，自己錄取了PCR的準備、操作以及電泳檢測等全套過程，老師講得省心，同學們聽得舒心，極大提高了基因工程課程的教學效果。
2.小組討論式教學。有價值的討論是促進學生開動腦筋、舉一反三、加深認識的有效手段。在遇到抽象內容時，講解完畢后，鼓勵學生分組討論，并選出一名組長上講臺以PPT的形式匯報本小組的學習心得，組長實行輪換制。下面的同學給匯報的小組分別從以下幾方面打分：匯報PPT的表現，制作PPT的質量，所講內容的條理性、創新性以及講解能力。通過此手段，極大調動了學生的學習積極性。例如，可引導學生討論以下專題：①轉基因動物；②中國的轉基因水稻；③基因工程產品的安全性；④基因治療。
三、改革實驗教學、科研項目與課程教學相結合
本?；蚬こ虒嶒炇窃诖笕Y束后的暑假短學期開展的，共16學時，這時學生已上完基因工程理論課，具備了實驗操作的相關理論知識。實驗內容至關重要，是理論知識的綜合運用。那么如何選擇實驗內容呢？這一點比較關鍵。授課教師多具有博士學位，承擔著較高水平的科學研究工作。在基因工程教學過程中，嘗試將實驗內容和教師的科研項目相結合，讓學生自主參與到科研項目的研究中。學生可根據教師的科研項目自主確定實驗課程內容，從實驗內容的選擇，到實驗方案的設計、試劑的購置、實驗步驟的進行等都由學生自主完成，老師在此過程中起指導作用。筆者將課題“曼氏無針烏賊微衛星富集文庫的構建”分解成幾個小實驗，包括PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、限制性內切酶酶切反應、載體連接、感受態細胞的制備及轉化、藍白斑篩選與鑒定、測序、序列分析和引物設計等，指導學生進行整個流程實驗，使其知識更具有系統性、完整性。此外，還可鼓勵學生申報省級或校級的大學生創新項目，由筆者指導的“轉基因綠色熒光觀賞魚開發技術探索”以及“青魚β-actin基因的啟動子功能初步檢驗”分別獲得省級可喜獎項，這個實驗培養了學生的創新能力及今后獨立從事科研的能力。
四、試探采用雙語教學
現代高素質專業人才不僅要具備高水平的專業知識，還應具備高水平的專業外語閱讀與寫作能力。為適應學科發展趨勢，并擴充學生的英語專業詞匯，培養英語思維模式，在基因工程教學過程匯總嘗試進行雙語教學[5]。在教學上，以中文課件為主，主要的專業詞匯用英文標注，時而用英文講解，盡量創造雙語教學環境。并且鼓勵學生借閱相關的英文教材，例如，在國際上使用廣泛，權威性和時代感強的英文教材《Principles of gene manipulation and genomics》（7th ed）作為教學參考書。
簡而言之，經過幾年的努力工作，浙江海洋學院在基因工程課程的教學內容方面進行了優化，改進了教學方法與手段，培養了實驗設計能力和創新意識，拓展了他們的知識面，取得了不錯的效果。然而，課程教學改革是一項系統工程，目前還處于探索和實踐階段，必須堅持不斷地探索、實踐、總結，最好建立一支教學團隊，希望把基因工程課程教學改革工作開展得更有效果，為國家輸送更多高素質的專業人才。
參考文獻：
[1]孫明.基因工程[M].北京：高等教育出版社，2006：1-6.
[2]李立家，肖庚富.基因工程[M].北京：科學出版社，2004：1-8.
尤為業內矚目的是，汪道文教授在國內率先建立和開展了心腦血管病新危險因素的檢測臨床研究，并率先開展了疾病的基因診斷和以基因診斷與分型為基礎的個體化診斷醫療。他和他的團隊先后開展基因診斷項目600余項，為臨床解決了大量疑難問題；在心律失常、肥厚型心肌病、嬰兒黃疸和大血管疾病等的基因診斷方面走在了國際前列。
陽春三月，在第六屆國際心血管病靶向治療論壇（CTT 2015）召開期間，本刊記者就“疾病的基因診斷和基因診斷與分型”以及基于此的“疾病個體化診斷醫療”等話題，對汪道文教授作了深入采訪。
“量體裁衣”，
基因診斷助推個體化醫療
采訪一開始，汪道文教授首先詮釋說：“隨著人類基因組學、藥物基因組學及分子生物學研究的不斷深入和發展，人們對疾病多成因、異質性及個體化差異的特點有了更加全面的認識。個體化治療已成為臨床治療的發展方向和最有效的手段；個體化醫療的理念也被推至前臺，已被越來越多的科研工作者和臨床醫生所認識和接受?！?/p>
汪道文教授進一步解釋說，所謂個體化醫療（Personalized Medicine， Individualized Medicine），即認定病人對不同藥物和治療反應的遺傳學變異，針對致病分子靶向治療； 此外，還發展和利用以遺傳和分子機制的診斷，以更好地預測對靶向治療的反應。
他認為：“基于基因診斷技術的個體化醫療之根本，在于根據病人個體的遺傳結構差異，實現‘量體裁衣’式的個體化用藥方式，而這將成為未來理想的治病新模式。但從臨床上看，早期預測，個體化的治療并非像簡單的遺傳變異分析那樣簡單。個體化醫療的一個重點就是強調提前干預。如果通過基因測序發現有糖尿病或者心血管疾病發病風險，就可以在飲食方面做一些先行調整，改善營養平衡，延緩降低發病幾率和時間；可以在人們尚無任何癥狀的情況下，通過基因檢測預測1年或5年以后患有某些疾病的風險有多大，比如某好萊塢電影明星有乳腺癌家族史，她通過基因檢測發現帶有乳腺癌遺傳突變基因，于是就做預防性切除術，降低了患癌風險。這就是典型的在發病以前進行積極干預的事例。因此隨著個體化醫療的逐步發展，針對個體化的檢查和監測將成為現實。而這將對心血管疾病的早期檢測和干預提供極大的幫助，對心血管疾病的早期發現、早期診斷治療及預后的改善，產生積極影響?！?/p>
汪道文教授繼續詮釋說，個體化醫療中所謂的“量體裁衣”，是指根據服務對象在生物分子水平的特征，制定有針對性的保健措施和治療方案。在這方面，藥理遺傳學的興起極大地推動了個體化醫療的發展；特別是在心血管領域，藥理遺傳學已經成為一門熱門的研究方向，最有代表性的就是華法林的個體化用藥及抗血小板藥的個體化選擇。近年來，隨著藥物基因組學的不斷深入，依賴于藥理遺傳學的結果而建立起來的華法林維持劑量應用模型，不斷地在嘗試應用于臨床。
據了解，在最近的AHA會議上，EU-PACT研究發現按基因型確定華法林劑量，優于使用臨床標準劑量（N Engl J Med. 2013 Nov 19）。對此汪道文教授談到：“確實，我們同濟醫院心血管實驗室已完成了近1000例患者基因分型指導華法林劑量的調整。我們的臨床實踐證明，通過基因分型，按照藥理遺傳學模型能非常準確有效地指導臨床華法林應用，可大大減少INR的檢查和降低由于用量問題帶來的風險。因此我們相信，隨著研究的繼續深入和藥物治療模式的不斷改進，臨床上采用以藥物遺傳學為基礎實行華法林的個體化治療時代已經來臨！”
“4P醫學”將在未來
真正得以實現
采訪前記者獲悉，學術界曾有一種看法：目前開展的人類基因測序產生了海量數據，這至少帶來了兩個問題，一是存儲所占空間太大，傳輸、計算也會變得很慢；二是如何篩選有用數據的難度也進一步增大。那么，在心血管疾病的基因診療方面，如何有效用好海量數據、提高診斷治療效果？
對此問題，汪道文教授介紹說：“對于高通量測序帶來的巨大數據量，我們的做法是，引進專業服務器對數據進行存儲和分析。這一方面緩解了海量數據帶來的存儲壓力，另一方面經數據處理的本地化相比數據上傳至云端，原始測序數據就能得到更快、更全面的分析，大大提高了工作效率?！?/p>
汪道文教授也認為，高通量測序產生的海量數據，的確對數據的分析和采用提出了更高的要求，而從龐雜的突變（或多態性位點）中準確識別致病突變，既是高通量測序技術應用于臨床檢測的基本要求，同時也是難點之一。針對這些問題汪道文教授解釋說：“在數據分析過程中，我們的科研技術人員會經過數據的篩選，數據庫和文獻庫的比對，并結合臨床，最終判斷一個突變是不是致病突變?？偟膩碚f，致病突變的識別，一部分來自于已有的基礎研究，我們的研究技術人員必須掌握前沿的科研成果，并及時更新我們已有的突變數據庫，以準確識別致病突變；對于一些我們認為有價值但還沒有研究基礎的可疑致病突變，我們也會深入地開展功能相關研究，將我們自己的研究成果運用于臨床檢測。另外，表型和突變聯系緊密的家系，也能為我們提供報道致病突變的依據。只有充分掌握疾病的相關遺傳學研究成果，并積極開展表型-基因型關系的研究，建立嚴格的致病突變識別流程，才能準確并高效地將高通量測序技術應用到臨床診療，否則，龐雜的測序數據對病人來說，無異于一部‘天書’，而為病人準確地解讀這部‘天書’，則是相關從業人員的責任?！?/p>
在采訪中汪道文教授強調：“需要指出的是，現在人類的基因組測序已經完成，但是具體單個基因或者某一段基因與疾病的關聯性的研究，還遠遠沒有達到預期目標，而這也是全世界科研工作者正在努力的方向；特別是在國內，基因診斷才剛剛起步，個體化醫療的路程還很長，但我們堅信，隨著生物醫學技術的飛速發展，我們對于許多疾病的分子機制會了解得更加深刻。個體化醫療將會在基因分子層面早期預測疾病，從而降低發病風險，延緩發病時間，最終改善患者預后。另一方面，個體化醫療的發展與臨床息息相關，這需要不斷加強對臨床醫生的教育和培訓。以美國為例，臨床醫生的培訓對于基礎醫學的要求是比較高的，許多人進入臨床工作以后，仍然在分子生物學、生物化學等方面有很好的造詣。這一點對于中國來說還比較欠缺，這也是阻礙我們臨床醫生水平提高的障礙之一。針對這些問題，我們曾經舉辦過‘全國基因診斷與基因分型臨床應用學習班’，其目的就是希望我們能通過舉辦學習班，將基因診斷及個體化醫療的概念灌輸到每一個人的腦海中，將分子醫學的種子播散到每一個人的心田；同時通過培訓，也希望他們將基因診斷及個體化醫療的意識帶回到本科室、本醫院、本地區，以此在全國范圍內逐步普及基因診斷及個體化醫療的相關知識?！?/p>
此前記者了解到，隨著抗血小板藥物的廣泛使用，人們發現并不是所有規則用藥的患者都能獲得一致的臨床療效。近年的研究表明，長期應用抗血小板藥物，導致約50%的患者療效降低或無效。汪道文教授曾長期進行基因多態與抗血小板的治療研究，那么，這項研究將會給抗血小板臨床治療帶來哪些影響？
對此問題，汪道文教授談到：“根據血小板功能和個體化基因型采用個體化抗血小板策略，仍然是心血管領域未來的發展方向。更廣泛地開展個體化抗血小板治療，以帶來心血管預后的改善，仍然需要更多的臨床試驗結果支持。同時，隨著分子生物學技術的發展，利用全基因組關聯研究策略進行藥物代謝酶相關基因進行變異篩查，結合臨床多中心、隨機、雙盲、對照試驗，相信在不久的將來，我們能夠為每一位需要抗血小板治療的患者進行分子分型，解讀人類的基因‘天書’，并為其貼上一個‘基因標簽’，這無疑會對個體化診療以及療效評估帶來益處。這方面，仍然需要加強對醫生的繼續教育，同時根據中國人的特殊基因型和基因變異頻率，制定適宜中國人群的個體化用藥方案?！?/p>
“總之，個體化醫學將是醫學發展的趨勢。我們期待在不久的將來，‘4P醫學’將真正實現：預測（Predictive）、預防（Preventive）、個體化（Personalized）、參與（Participatory）?！蓖舻牢慕淌跐M懷信心地說。
我們的成就主要來自于勤奮
醫學界的很多人都明白，從現實的角度而言，醫學基礎研究很多時候是“得不償失”的，但據記者了解，在汪道文教授的帶領下，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院心血管內科，卻把基礎研究放在了科研的重要位置，并取得了實驗室滿負荷工作，取得了平均每年發表SCI論文15篇至20篇的重要成就。作為教育部重點學科和國家衛生計生委臨床重點專科，該院的心血管內科在醫院發展戰略基礎上，努力加強學科內涵建設，矢志成為服務全省、輻射全國的強勢學科。
那么，他們這個科室開展基礎研究的情況，又有哪些經驗可以與大家分享？問及這一話題，汪道文教授首先介紹說，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院心血管內科的基礎研究，主要以心腦血管病領域內源性保護機制為重點，特別在組織型激肽釋放酶（TK）、一氧化氮合酶（eNOS）心血管保護和表氧化酶-EETs代謝方面有重要突破。
汪道文教授認為：“我們之所以能取得這些成就，主要還應歸功于勤奮。我們實驗室的滿負荷工作是基于24小時工作時間的基礎上，其研究方向由不同的實驗小組來完成；此外，我們還有一個較好的學術研究梯隊，形成了以老帶新、傳幫帶的氛圍。每位研究生到實驗室做實驗，首先會被告知全年無節假日，要有充分吃苦耐勞的心理準備。他們會被分到不同的小組展開實驗研究，實驗室會定期開展學習，匯報研究進展，討論下一步的實驗開展計劃，并邀請全國甚至全世界該領域的頂尖專家交流學習最新進展，為實驗工作的有序進行打下了堅實的基礎?！?/p>
在取得這些成就的同時，他們還不遺余力地把學術交流、推廣與規范培訓當成另一項重要使命。他們在連續6年成功主辦“同濟心血管疾病高峰論壇”的基礎上，2014年10月10日至12日，又成功主辦了“第七屆同濟心血管疾病高峰論壇”暨“全國基因診斷與基因分型臨床應用學習班”。對此汪道文教授介紹說：“去年的論壇邀請了全國心血管領域及基礎領域20多名專家授課，吸引了湖北省及周邊地區40多個縣市的醫務工作人員500余人前來參加。本次論壇分為基礎論壇、電生理三維演示訓練會、臨床診療進展和臨床病例討論4個部分。內容涉及介入心臟病學、心臟起搏與電生理學、心力衰竭、高血壓及心腦血管疾病的基礎研究，尤其突出了具有同濟醫院特點的大血管疾病診治新技術；病例討論是本次會議的另一特點，吸引了廣大基層醫生的廣泛參與和熱情討論；其最大的亮點是新增了急危重癥專場討論部分，有極大的臨床實用性?！?/p>
【關鍵詞】 小干擾RNA; 結直腸癌; FAK; 細胞增殖; 細胞運動
[Abstract] AIM: To investigate the effect of siRNA targeting FAK gene on proliferation and motility of colorectal cancer. METHODS: Recombinant plasmids that produced siRNAs targeting FAK were designed and cloned， then transfected into Caco2 cells. The changes of FAK expression levels were examined by RTPCR and immunocytochemistry. The effects of FAK gene knockdown on apoptotic morphological changes， proliferation， and motility were investigated. RESULTS: Recombinant plasmids targeting FAK were successfully constructed， FAK mRNA and protein level was silenced in Caco2 cells significantly. The inhibition of mRNA level was achieved maximal at 48 h post transfection with time dependent. The ability of proliferation and motility of Caco2 cells were significantly decreased. CONCLUSION: Plasmidmediated FAK siRNA could inhibit FAK gene expression. The proliferation， motility and apoptosis were inhibited effectively， which suggested that FAK expression is closely associated with the proliferation， motility and apoptosis， etc. The results may be used as the reference for gene therapy of colorectal cancer.
[Keywords]small interfering RNA; colorectal cancer; FAK; cell proliferation; cell motility
近年來以黏附相關因子為靶點的治療成為基因治療研究的新策略[1]， 黏著斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)是近年來發現的細胞黏附介導的信號通路的重要因子， 作為胞內信號蛋白酪氨酸激酶， 于1992年被獨立鑒定為Src癌基因的底物。FAK的相對分子質量(Mr)為125 000， 定位于人染色體8q24， 與cmyc基因座接近， 此基因座在人癌細胞中往往被激活而強化[2]。FAK作為信號轉導的關鍵分子， 可傳遞由胞外到胞內的多種信號， 其在結腸癌中表達升高而在正常組織細胞中表達呈弱陽性的特點開始引起研究人員的關注[3]。有研究顯示， FAK基因在結直腸癌組織中表達升高[4]， 并與癌細胞增殖、 侵襲轉移密切相關， 但作用機制還不明確。本實驗將靶向FAK基因的siRNA表達載體導入Caco2細胞， 探索FAK siRNA對結直腸癌細胞增殖和遷移的影響并初步探討其作用機制， 為結直腸癌基因治療積累實驗資料。
1 材料和方法
1.1 材料 人結直腸癌細胞株Caco2購于美國ATCC。重組質粒pU6H1GFP/FAKsiRNA為本實驗室設計、 百奧生物技術有限公司(南通)構建， 大小為5.5 kb， 經測序正確。限制性內切酶Hind Ⅲ購自NEB公司。脂質體Lipofectamine 2000、 TRIzol試劑均為美國Invitrogen公司產品。RPMI1640培養基購自美國Gibco公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Amresco公司。RT007 AMV反轉錄酶購自杭州博日科技有限公司。FAK、 GAPDH引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。針對FAK的單克隆抗體(mAb)購自Santa Cruz公司。SP免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。Hoechst 33258購自南京凱基基因有限公司。其他試劑均為國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 siRNA的設計及構建 利用Ambion siRNA在線軟件設計了2條針對FAK的siRNA: siFAK1: 5′GGGCAGACGAGACCACACTGA3′; siFAK2: 5′GAAATGGAAGAAGATCAGCGCT3′; 錯義對照序列siRNASCR: 5′GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC3′。經Blast比對證實與人其它基因無同源性后構建合成siRNA表達載體， 雙啟動子U6和H1之間插入人FAK及錯義siRNA靶序列。
1.2.2 細胞轉染 于6孔培養板， 將Caco2細胞接種于無抗生素、 含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液， 細胞接種密度: 2×105/孔， 飽和濕度培養24 h。參照Lipofectamine 2000說明書進行轉染優化， 轉染后6 h更換完全培養基。實驗分為: 正常對照組(未轉染的Caco2)、 錯義siRNASCR組(非特異性siRNA轉染)、 干擾組siFAK1、 siFAK2。
1.2.3 GFP表達檢測及轉染效率評價 轉染后細胞于激發波長為488 nm的熒光倒置顯微鏡下檢測GFP的表達情況。以放大100倍的視野為標準， 計5個視野表達綠色熒光的細胞數和總細胞數， 求GFP表達率: GFP表達率=發綠色熒光細胞數/細胞總數×100%。
1.2.4 細胞凋亡形態學檢測 取對數生長期細胞以2×105/孔接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中， 每組爬片4張， 轉染48 h后棄培養液， PBS洗3次， 40 g/L多聚甲醛4℃固定15 min， PBS洗3次， 吸凈液體， 每孔加入200 μL Hoeschst 33258工作液， 避光孵育10 min， PBS漂洗封片， 熒光顯微鏡下隨機選取高倍視野進行拍照， 激發光波長為365 nm。
1.2.5 RTPCR檢測 收集轉染后24、 48、 72、 96 h細胞， 各組細胞總RNA按TRIzol試劑說明書提取。將總RNA(0.5 μg)行10 μL反轉錄體系。取cDNA再進行25 μL PCR反應。PCR循環參數為: 95℃預變性2 min; 94℃變性40 s， 46℃退火40 s， 72℃延伸1 min， 共28個循環(GAPDH: 18個循環)， 于72℃延伸10 min。FAK上游引物: 5′GCGTCTAATCCGACAGCA3′， 下游引物: 5′GCCGACTTCCTTCACCAT3′， 擴增產物為445 bp; 內參GAPDH上游引物: 5′AATCCCATCACCATCTTCCA3′， 下游引物: 5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′， 擴增產物為580 bp。各取5 μL擴增產物， 經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 凝膠成像儀下觀察結果及照相， BandScan 5.0進行條帶分析， 檢測各組FAK與GAPDH的灰度比值表示FAK mRNA表達水平變化， 比值越高說明目的基因表達越高。
1.2.6 細胞增殖檢測 調整細胞密度為6 000個/孔， 接種至96孔板， 設Blank組(只加完全RPMI1640培養液)、 siRNASCR組、 正常對照組、 干擾組(siFAK1、 siFAK2)， 每組每個時間點設6個復孔。培養24 h后棄上清， 進行轉染(脂質體: 0.5 μL， DNA: 0.2 μg)。于孵箱中繼續培養24、 48、 72、 96 h后每孔加入MTT(1 g/L)15 L， 37℃、 50 mL/L CO2避光孵育5 h， 再加入100 μL DMSO振蕩10 min， 酶標儀562 nm處測定各孔A值。生長抑制率=(1-處理組平均A值)/正常對照組平均A值×100%。
1.2.7 細胞遷移檢測 于6孔板內按上述方法進行轉染， 培養24 h后用外接真空泵的1 mL移液槍頭(直徑1.5 mm)垂直于6孔板板底分別打孔， PBS清洗2次， 更換完全培養液。分組同1.2.2， 40倍倒置顯微鏡下照相。于轉染后48、 72、 96、 120 h繼續照相， Gene Tools軟件測定每孔各時間點面積。遷移率=(1-該時間點損傷面積)/原始損傷面積×100%。
1.2.8 免疫細胞化學檢測 將細胞接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中(1.5×105/孔)， 每組爬片4張。設陰性對照組(PBS代替一抗)、 siRNASCR組、 正常對照組、 siFAK1和siFAK2共5組。轉染48 h后取蓋玻片用SP試劑盒檢測， FAK mAb稀釋度為1∶300， 避光條件下， DAB顯色， 三蒸水沖洗停顯， 梯度酒精脫水， 二甲苯透明， 取出蓋玻片置于載玻片上， 胞質出現棕褐色為陽性染色。中性樹膠封片后， 每組隨機選取10個高倍視野(×200)， 進行圖像采集。
1.2.9 統計學分析 數據以x±s表示， 采用SPSS15.0軟件進行方差分析。P
2 結果
2.1 重組質粒pU6H1GFP酶切鑒定 用Omega無內毒素質粒小提試劑盒擴增并純化質粒， 經Hind Ⅲ 酶切鑒定， 可見質?？杀磺懈畛纱蠹s5.5 kb的線性片段， 結果完全正確(圖1)。
2.2 轉染效率 經優化的脂質體條件轉染后， GFP表達率為(44.59±2.71)%。
2.3 細胞凋亡的形態學觀察 經Hoechst 33258染色可見正常對照組細胞染色質為彌漫均勻的低強度熒光， 無明顯凋亡特征(圖2A); 經siFAK1和siFAK2組轉染細胞48 h后， 細胞表現出典型的凋亡形態學變化， 胞核呈濃染致密的固縮形態、 斷裂成塊、 呈顆粒狀亮藍色熒光， 且有少量凋亡小體出現(圖2D、 E中箭頭所示)。脂質體組及siRNASCR組均沒有出現明顯的凋亡形態學改變(圖2B、 C)。因此可得出脂質體試劑及pU6H1GFP載體對轉染無明顯影響， 排除假陽性的干擾。
2.4 FAK mRNA表達變化 轉染Caco2細胞于24、 48、 72、 96 h后檢測siRNA敲低FAK mRNA水平表達的時間效應關系， 并確定敲低效果最好的1條序列。RTPCR結果顯示， 各組內相應內參GAPDH的條帶基本一致， siFAK1和siFAK2組FAK mRNA水平低于正常組和siRNASCR組， 且敲低效應在轉染后24～48 h范圍內呈時間依賴性降低， 至48 h降到最低(P
2.5 細胞增殖狀況 MTT法檢測表明， siFAK1和siFAK2組細胞增殖抑制率明顯增加(圖4)。與正常對照組相比， siFAK1和siFAK2對細胞增殖的抑制率在轉染后24～72 h均有統計學意義(P
2.6 細胞遷移狀況 與正常組相比， 特異性siFAK1、 siFAK2組使Caco2細胞的遷移率明顯降低(P
2.7 FAK蛋白表達變化 免疫細胞化學方法檢測結果顯示， 正常組FAK表達多位于胞質， 呈棕褐色， 強陽性表達， 而siFAK1、 siFAK2組細胞中FAK蛋白的表達明顯減弱(圖6)。ImagePro Plus 6.0圖像分析各組的A值， 轉染后48 h siRNASCR組、 正常對照組、 siFAK1及siFAK2光密度分析結果分別為0.223±0.006、 0.254±0.002、 0.059±0.006、 0.079±0.008?？梢娹D染后48 h兩個干擾組的蛋白表達明顯被抑制(P
3 討論
FAK作為Src癌基因的底物， 位于整合素富集的黏著斑處， 與多種信號分子相互作用， 介導多種細胞表面受體激活及信號傳輸來調控細胞骨架組建、 細胞增殖、 凋亡及存活、 細胞轉移及入侵等， 最終參與腫瘤的發生。有研究表明， 在正常結直腸上皮細胞中FAK表達呈弱陽性或陰性[5]， 這與維持上皮細胞的生理功能是不可缺少的; 而在結直腸癌相關的細胞中FAK表達明顯升高， 說明其表達上調可能是結直腸癌具有惡性表型的早期事件。因此， FAK作為腫瘤發生進程相關的關鍵分子可能成為腫瘤治療的靶點， 而抑制FAK的表達則有望成為腫瘤基因治療的新熱點。針對FAK基因的反義寡核苷酸治療結直腸癌的研究已有報道[6]。RNAi是近年來快速發展的一種高效的基因沉默技術， 并作為一種關鍵技術應用于抗腫瘤、 基因功能研究[7]。
本實驗以Caco2細胞為研究對象， 采用針對FAK mRNA的特異性siRNA重組表達質粒進行轉染。RTPCR顯示， 所設計的兩個siFAK重組質粒均能使其mRNA水平下降， 其中以siFAK1干擾效果更強， 在轉染后48 h敲低效果最明顯， 說明siRNA對FAK的抑制作用可能有時相性。而錯義組則沒有上述作用， 從而另一方面證明RNA干擾的特異性。同時免疫細胞化學檢測結果也顯示轉染后48 h siFAK1對細胞FAK蛋白抑制更明顯。
細胞增殖和遷移在多種惡性腫瘤的病理生理過程中起重要作用。有研究表明[8]， 活化的FAKRASMAPK是促進細胞遷移和增殖的重要信號通路。本研究中， 細胞增殖及遷移實驗表明， 靶向FAK基因干擾Caco2細胞后， 細胞貼壁能力降低， 變圓易脫落， 細胞的增殖及遷移明顯受抑， 因此我們推測FAK基因表達受抑可使FAKRASMAPK信號通路受阻， 最終導致細胞增殖及遷移能力降低， 提示FAK基因可能是結直腸癌腫瘤治療的一個新靶點。相反siRNASCR組對細胞的增殖及遷移無明顯影響， 因此可以斷定質粒載體pU6H1GFP可以作為安全有效的基因載體。近年來有關研究表明FAK與腫瘤細胞的凋亡相關。Huang等[9]發現FAK通過活化PI3K/Akt及MAPK/ERK1/2信號存活通路而引發NFκB活化， 最終阻斷caspase3級聯反應， 使細胞凋亡受抑。因此FAK的表達與凋亡密切相關。本實驗初步研究結果顯示， 通過Hoechst熒光染色發現siFAK轉染Caco2細胞48 h后細胞呈現凋亡的形態學變化: 核致密濃縮， 染色體斷裂， 并出現凋亡小體等特征。從分子機制來說， FAKsiRNA可能通過下調FAK mRNA和蛋白表達水平而促使Caco2細胞凋亡。
實驗中2個siFAK重組質粒對靶基因的抑制效應不同， 其中以siFAK1抑制FAK基因mRNA、 增殖及遷移的作用最為明顯， 這種針對同一基因的不同靶點而產生的不同干擾效果， 可能與位置效應有關[10]。因此說明利用RNA干擾進行腫瘤臨床治療要對干擾序列進行篩選。
綜上所述， FAK與腫瘤的發生、 發展密切相關， 我們的初步研究結果表明， 干擾FAK基因表達后使Caco2細胞增殖、 遷移力明顯減緩、 細胞出現凋亡等現象， 且FAK基因表達受抑后胞質形態結構受損， 其機制可能與抑制Caco2細胞FAK mRNA和蛋白表達水平有關。因此靶向抑制FAK基因的表達， 可能是結直腸癌治療的有效途徑。此研究為RNAi在腫瘤治療方面奠定了實驗基礎， 也為臨床研究和進一步的治療研發提供了更多的依據。
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1 腫瘤MDR產生的機制
MDR的發生是腫瘤細胞從細胞膜、細胞質和細胞核內產生的多種途徑綜合作用的結果，其形成機制非常復雜，其產生機制如下。
1.1 膜糖蛋白介導的MDR
1.1.1 P糖蛋白介導的經典MDR P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）是由多藥耐藥基因MDR1編碼的一種分子量為170kD的跨膜糖蛋白，它屬于典型的ABC(ATPbinding cassette)轉運蛋白超家族成員[2]。Pgp是一個ATP依賴性的藥物外排泵，能利用ATP水解釋放的能量主動將疏水親脂性化療藥物轉運至細胞外，導致細胞內藥物濃度低于殺傷濃度，從而使腫瘤細胞產生MDR[3]。
1.1.2 多藥耐藥相關蛋白介導的MDR 多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）是由1531個氨基酸組成的分子量為190kD的跨膜糖蛋白[4]。它與Pgp有某種程度上的序列同源性，同屬ABC轉運蛋白超家族。MRP可通過促進谷胱甘肽結合藥物從細胞內的排出而產生MDR[5]。
1.1.3 乳腺癌耐藥蛋白介導的MDR 乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是由655個氨基酸組成的分子量為72.6kD的跨膜蛋白，屬于ABC轉運蛋白家族中的半轉運蛋白，由一個疏水跨膜區和一個核苷酸結合區構成。兩個BCRP分子通過二硫間形成同源或異源二聚體后才具有轉運活性[6]。BCRP可以降低阿霉素、柔紅霉素等在腫瘤細胞內的積累從而產生耐藥性[7]。
1.1.4 肺耐藥相關蛋白介導的MDR 肺耐藥相關蛋白（lung resistancerelated protein，LRP）是一種分子量為110kD的蛋白質。LRP與Pgp、MRP、BCRP的作用機制不同，它主要通過核靶點屏蔽機制引起MDR，LRP可以使以細胞核為靶點的藥物不能通過核孔進入細胞核，有些藥物即使進入核內也會很快被轉運到胞質中[8]。
1.2 酶介導的MDR
1.2.1 谷胱甘肽S轉移酶介導的MDR 谷胱甘肽S轉移酶(glutathionestransferase，GST) 是一組與細胞解毒功能有關的酶，分為α、μ和π等多種同工酶，各由GST 超基因家族的相應基因編碼。GST 通過催化谷胱甘肽(glutathione，GSH)與藥物結合，使兩者形成復合物而解毒，導致腫瘤細胞產生耐藥性。GST本身也可與親脂性藥物結合增加其水溶性，促進外排而降低化療藥物的細胞毒作用，同樣也引起腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性。烷化劑和鉑類藥物均可通過這一途徑解毒。
1.2.2 拓撲異構酶Ⅱ介導的MDR 拓撲異構酶Ⅱ（topoisomerase，TopoⅡ）是存在于細胞核內催化DNA雙鏈拓撲異構體相互轉換的基本核酶[9]，可改變DNA 的拓撲形式，參與DNA 復制、轉錄、重組和修復等許多重要活動。研究表明，TopoⅡ介導的MDR表纖維耐藥細胞酶轉錄水平和活性降低，同時，TopoⅡ還可以參與特殊耐藥基因的調控，合成出具有特殊排泵功能的膜蛋白，將藥物泵出胞外，從而產生耐藥。一般說來，TopoⅡ異常所致的MDR有以下特點：①對許多天然藥物呈現抗藥性；②膜活性藥物不能提高抗腫瘤藥物的細胞毒作用；③藥物在細胞內聚積與外排無變化；④MDR1與Pgp表達未增加；⑤TopoⅡ含量及活性均有所下降。
1.2.3 蛋白激酶C介導的MDR 蛋白激酶C(proteinkinase C，PKC)是由一個超基因家族編碼同源性很高的相關分子組成的一組酶，在MDR的發生、發展中起重要作用。研究發現，PKC幾乎參與所有MDR機制的調節[10，11]。Pgp是PKC 催化磷酸化的底物，Pgp 磷酸化后可被激活，使其藥物外排功能增強。另外，PKC 也可使MRP、LRP、GST 和Topo II 磷酸化，分別增強它們的活性。
1.3 凋亡調控基因介導的MDR
多數化療藥物是通過誘導腫瘤細胞發生程序性死亡(PCD) 即凋亡來達到治療目的，反之，腫瘤細胞也可通過逃逸凋亡或拮抗凋亡獲得生存，即產生多藥耐藥。目前研究比較多的是bcl2基因和p53基因。
1.3.1 bcl2基因 bcl2是最重要的細胞凋亡抑制基因，它位于18號染色體上（18q21）。bcl2基因過表達可以促進細胞的生存，同時也抑制放射線、化療藥物等誘導的細胞凋亡。bcl2基因轉染bcl2低表達的腫瘤細胞，被轉染細胞bcl2表達增強，對大多數細胞毒藥物產生耐受[12，13]。用針對bcl2 mRNA的反義寡核苷酸處理多發性骨髓瘤患者的惡性漿細胞，bcl2蛋白表達量減少，并伴有凋亡增加和對化療藥物的敏感性增加[14]。臨床上許多白血病和實體瘤細胞中bcl2基因的表達較高者，往往同時伴有放、化療耐受。
1.3.2 p53基因 p53基因有野生型和突變型兩種存在形式。野生型p53被視為細胞生長的“監控器”，能誘導DNA損傷的細胞進入G1/S期，抑制細胞增殖直至損傷DNA得到修復，若修復失敗則誘導損傷細胞凋亡。當p53基因發生突變、缺失導致表達異常時（突變型p53），其對凋亡的控制也會發生異常，這時化療藥物所誘發的細胞凋亡受到抑制，導致腫瘤細胞對化療藥物的耐受顯著增強。同時基因的突變也可能特異性激活MDR1/Pgp啟動子使腫瘤細胞產生MDR。
其他參與凋亡調控的基因如cmyc、ras、fas/apo1、bcr/abl、cerB2/neu等也與腫瘤細胞耐藥的發生相關聯。
1.4 DNA異常修復引起的MDR
DNA是傳統的化療藥物烷化劑和鉑類化合物的作用靶點，它們通過直接破壞DNA結構的完整性引起DNA損傷而殺傷腫瘤細胞。這種DNA損傷的異常修復會使腫瘤細胞產生耐藥性。涉及以下機制：(1)腫瘤細胞DNA鳥嘌呤堿基第6位氧原子烷基化導致細胞突變死亡是烷化劑的重要殺傷機制。O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(06methylguanine DNA ethyltransferaes，MGMT)可將DNA中O6甲基鳥嘌呤甲基轉移至酶自身的半胱氨酸殘基上，通過修復烷化劑對細胞DNA的損傷使細胞產生耐藥性。(2)核苷酸切割修復(nucleotide excision repair，NER)是一種復雜的修復機制，能切除2729個堿基長度的DNA損害，理論上NER能切除任何使DNA雙螺旋產生較大變化的DNA損傷。(3)錯配修復(mismatch repair，MMR)能識別結構正常的非配對堿基間錯配的微小改變。MMR系統缺陷使細胞識別DNA損傷的能力減弱，而不產生引起細胞凋亡的信號。MMR功能喪失導致基因組不穩定性增加，產生對抗癌藥耐受的突變體。
2 腫瘤MDR的逆轉策略
隨著腫瘤細胞MDR分子基礎和發生機制研究的不斷深入，用不同手段和方法來克服腫瘤細胞的MDR已在實驗和臨床應用方面有了很大進展。目前常采用以下幾種逆轉策略。
2.1 化學藥物治療
針對腫瘤MDR的產生過程，應用多藥耐藥逆轉劑是解決腫瘤MDR的主要手段。經過二十多年的開發研究，已發現大量具有MDR逆轉活性的化合物，主要包括：鈣通道阻滯劑(維拉帕米及其衍生物)、鈣調蛋白抑制劑(噻吩嗪類化合物)、免疫抑制劑(環孢菌素A 及其衍生物)、類固醇和激素類似物(黃體酮、甲地孕酮) 等。但這類逆轉劑的毒副作用也使其臨床應用受到限制。
2.2 天然藥物（中藥）治療
天然藥物具有低毒、資源豐富、作用靶點多等特點。近年來許多學者把目光轉向天然藥物或中藥，探索天然的腫瘤MDR逆轉劑。研究證實有多種植物中藥具有逆轉MDR的作用，且逆轉方式各有特點。
中藥川芎嗪可下調MRP陽性表達率，使細胞內化療藥物濃度升高而逆轉MDR[15]。人參皂甙可下調mdr1mRNA的表達，導致其產物Pgp減少，從而使抗癌藥物在細胞內蓄積增加[16]。漢防己甲素（TTD）不僅能明顯提高細胞內化療藥物濃度，且能明顯增強化療藥物致細胞凋亡的作用[17]。千金藤素（CEP）通過降低NF κB活性，促進耐藥細胞凋亡逆轉MDR[18]。漏蘆抽提劑RHU通過促進耐藥細胞株凋亡，抑制腫瘤耐藥基因MDR/ Pgp的表達從而顯著逆轉多藥耐藥[19]。 冬凌草甲素可明顯誘導耐藥細胞凋亡，顯著地逆轉K256/ A02 細胞對柔紅霉素、高三尖杉酯堿的耐藥性[20]。蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿可競爭性地與Pgp結合，阻斷化療藥物外排而增強VCR對BEL7402細胞的細胞毒作用[21]。浙貝母堿能直接抑制糖蛋白的表達，明顯提高由Pgp或MRP介導的耐藥腫瘤細胞內抗癌藥物濃度[22]。茶多酚能明顯增加MCF7 /ADR細胞對阿霉素的敏感性，且其耐藥逆轉機制可能是Pgp[23]。槲皮素能夠下調MCF7/ADM細胞Pgp的表達從而逆轉MCF7/ADM細胞的MDR [24]。鴉膽子油乳通過競爭Pgp 對其他化療藥物的結合位點，從而抑制藥物泵出，在一定程度上逆轉K562/A02，MCF27/ADM，KB/VCR等細胞的耐藥性[25]。甲基蓮心堿可抑制Pgp 的功能和表達，減少藥物的外排從而克服MDR細胞的凋亡抗性[2627] 。葡萄籽多酚可能通過抑制Pgp 的表達、促進細胞凋亡而在體內、體外逆轉MCF7/ ADM細胞的耐藥性[2829]。欖香烯可下調抗凋亡基因bcl2的表達，促使耐藥細胞凋亡[30]。
目前中藥逆轉劑的研究主要集中在體外實驗，而對于其在體內的作用效果及安全性仍有待進一步的在體研究來驗證。這在一定程度上也阻礙了中藥在逆轉MDR方面前進的步伐及其在臨床的應用。
2.3 基因治療
基因治療是腫瘤治療的新方法，MDR的基因治療研究主要集中在MDR1 基因及某些癌相關基因。反義核酸技術、核酶技術及RNA干擾技術給耐藥逆轉提供了新的高效特異性的方法，較傳統的MDR 逆轉方法有較多優勢。
2.3.1 反義寡核苷酸技術 反義寡核苷酸技術(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)是指用一段人工合成的能與RNA或DNA互補結合的寡核苷酸鏈來抑制基因的表達。應用反義寡核苷酸技術治療MDR就是用一段人工合成的能與耐藥相關基因在轉錄水平上相結合的核苷酸來封閉多藥耐藥基因轉錄，從而改變其MDR 特性。
將MDR1基因的ASODN 導入表達MDR1基因的耐藥細胞后都可明顯下調Pgp的表達，提高細胞內化療藥物濃度[31]。將ASODN的3'端與阿霉素共價連接后作用于KBA1細胞，可使KBA1細胞內阿霉素濃度比單用阿霉素組高6.4倍，比單用ASODN組高1.8倍[32]。應用MRP ASODN可下調乳腺癌耐藥細胞MCF7/VP中MRP mRNA 表達[33]。多細胞卵巢癌球狀體有高水平P27和Pgp表達，而且其對紫杉醇的耐藥性較單層卵巢癌細胞更強。應用ASODN技術可以下調多細胞卵巢癌球狀體中P27和Pgp表達，從而增強其對紫杉醇的敏感性[34]。當然，反義寡核苷酸較短的半衰期及較高的制備成本也使其廣泛應用受到一定限制。
2.3.2 反義RNA技術 反義RNA技術指利用基因重組技術，構建人工表達載體，使其體外或體內表達反義RNA，從而抑制靶基因的表達。反義RNA是與多藥耐藥相關基因的mRNA形成二聚體而抑制mRNA翻譯，從而逆轉MDR。陳琳等[35] 應用自行構建的攜帶反義MRP的重組腺病毒體外轉染人肝癌耐藥細胞SMMC7721/ADM，使ADM、DNR對SMMC7721/ADM細胞的IC50分別為0.487μg/ml、0.328μg/ml，RF值分別為97.4、109.3，轉染后24h，MRP mRNA水平開始下降并呈持續下降趨勢，48h后伴有MRP蛋白表達的持續下降。表明MRP反義RNA可有效封閉MRP基因表達，有效逆轉肝癌耐藥細胞的MDR。陳綱等[36] 研究發現草酸鉑、5Fu聯合MDR1反義RNA對直腸癌耐藥細胞有協同殺傷作用，可望成為治療對5Fu耐藥的直腸癌的有效方法。還有研究顯示，MDR1反義RNA能下調人肝癌耐藥細胞SMMC7721/ADM中MDR1 mRNA和Pgp表達，使阿霉素和柔紅霉素對SMMC7721/ADM細胞的IC50分別下降了31.25%和62.96%[37]。反義RNA技術能夠提高化療藥物的敏感性，有效逆轉腫瘤MDR。
2.3.3 核酶技術 核酶是一類具有催化活性的RNA分子，它能特異性地識別mRNA中的GUC序列，并催化RNA的剪切反應，而其自身不被消耗可重復使用，具有高效率、高特異性、少副作用等特點。
特異性切割bcl2 mRNA 的核酶可有效地阻斷bcl2 蛋白合成，明顯促進紫杉醇誘導的細胞凋亡，提高紫杉醇化療效果，克服耐藥[38]。Kowalski等[39]用具有催化活性的抗BCRP的核酶處理257RNOV，結果發現257RNOVRzB1中BCRP mRNA 水平顯著降低，米托蒽醌IC50 ( the 50% inhibitory concentration) 值也明顯降低。王海等[40]利用核酶技術切割腫瘤多藥耐藥基因(MDR1)，結果發現，經抗MDR1核酶處理的人肝癌耐藥細胞株Hep G2 MDR1 mRNA、Pgp明顯降低，細胞內羅丹明聚集，對阿霉素的敏感性提高200倍。針對MDR1mRNA的二級結構設計的核酶（RZ135和RZ106）能夠下調乳腺癌耐藥細胞中MDR1mRNA和Pgp的表達，抑制Pgp的外排功能[41]。
2.3.4 RNA干擾技術 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是含21～23個核苷酸的小分子干擾RNA 片段(small interference RNAs，siRNA) 特異性地識別并降解其同源基因mRNA，誘導序列特異性基因沉默的過程?，F已廣泛應用到基因功能、基因表達調控等熱門領域，為基因治療開辟了新的途徑。
張曉菁等[42]用脂質體介導將MDR1特異性siRNA的表達載體(pSN/ mdr1a 和pSN/ mdr1b) 轉染阿霉素耐藥細胞株OVCAR/ AR和多藥耐藥亞株OVCAR/MDR細胞，可顯著抑制兩株耐藥細胞MDR1 mRNA 和Pgp的表達，OVCAR/MDR 和OVCAR/AR 細胞對阿霉素抗藥性的逆轉率分別為79.5%和93.9%。表明載體表達的MDR1特異性siRNA可抑制卵巢癌耐藥細胞MDR1基因的表達，增加耐藥細胞對化療藥物的敏感性。轉錄相關鋅帶蛋白基因(zinc ribbon domaincontaining 1 protein，ZNRD1) 可能通過類似轉錄因子的轉錄調節作用參與腫瘤多藥耐藥[43]，樸瑛等[44]構建了ZNRD1 基因的siRNA 載體并將其轉導入HL60/VCR細胞，轉染后的細胞對長春新堿和阿霉素的敏感性增強，且低表達Pgp 和bcl2 ，該siRNA真核表達載體在一定程度上逆轉了白血病細胞的耐藥性?？笰BCG2的siRNA和短發夾RNA可完全抑制ABCG2 mRNA及其轉運蛋白的表達，而且抗ABCG2的短發夾RNA使耐藥細胞中化療藥物濃度累積到親代敏感細胞水平[45]。與傳統反義RNA技術相比，RNAi設計更簡便、作用更迅速、效果更明顯。
3 展望
腫瘤多藥耐藥的問題仍然是目前臨床治療所面臨的主要困難之一，對其進行全面深入的研究將有助于惡性腫瘤的治療。臨床逆轉試驗的根本性突破，還有待于MDR機制的進一步明確。隨著高效低毒逆轉劑的不斷發現以及基因治療技術的不斷發展并逐漸應用于臨床，腫瘤對化療藥物的耐藥性將會被克服。
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一、福建省血液病專業和福建省醫學會血液病學分會的發展史
福建省醫學會血液病學分會是福建省血液病臨床和實驗研究工作者的群眾性學術團體。我省血液病學專業早在五十年代就在當時的福建醫學院附屬協和醫院開展，是全國較早開展血液病學研究的省份之一，當時臨床研究主要是常見血液病、白血病和淋巴瘤的治療?；A研究“紅細胞內游離原卟啉”的研究曾獲1978年全國醫藥衛生科學大會成果獎。1978年我省的“三尖杉酯堿治療白血病的研究”獲全國科技大會成果獎。同年福建省血液病研究室成立，掛靠在當時的福建省人民醫院和三明地區第一醫院。研究室于1988年7月經省編制委員會批準，擴大升為福建省血液病研究所。
1987年10月在龍巖市召開福建省第四次血液病學術會議，成立了福建省醫學會血液病學分會，并已分別于1991年、1998年、2004年進行換屆改選，歷任主任委員為：葉德富、黃淑樺、陳元仲、胡建達，呂聯煌教授為名譽主任委員。分會創建以來，400篇以上，主編和參編20多部專著、教材和參考書。有70項左右科研及教學成果獲國家、部省及省廳級科技成果獎，其中國家級科技成果獎3項。目前分會共有45名委員。
分會掛靠單位為福建醫科大學附屬協和醫院、福建省血液病研究所，研究所是一所集醫療、教學、科研于一體的應用型研究所，是福建醫科大學內科學（血液病學）博士點和重點學科，臨床醫學博士后科研流動站，福建省高等院校"211工程"重點學科，福建省科技廳的優先發展研究所，福建省教育廳和福建省衛生廳的重點學科，又是國家藥品臨床研究基地。目前全所有醫、護、技等專業技術人員75人，其中，教授7人，國家級專家3人，博士生導師4人，碩士生導師8人，有博士學位9人，碩士學位11人。研究所所長是呂聯煌教授。
研究所分臨床病房、臨床血液實驗室和基因工程實驗室等三部分。臨床部分為協和醫院第十二、十三兩個病區，共有病床109張，包括骨髓移植病床6張，還有全日制血液病專科門診。臨床血液實驗室有血細胞形態室、血液生化室、止血血栓室、流式細胞室等4個實驗室?；蚬こ虒嶒炇矣谢蛟\斷室、基因測序室、DNA/RNA合成室、核酸純化室、變性高效液相色譜室、細胞庫、無菌級動物實驗室等。研究所是全省血液病的診療和教學科研中心，為來自省內、外的白血病、惡性淋巴瘤、貧血、出血及其他血液病病人提供醫療服務，并為省內、外醫院培養血液病專業技術人才。
目前研究所的主要研究方向有：⑴血液病診療規范化及個體化研究；⑵血液腫瘤的轉錄基因組學、蛋白質組學和基因治療研究；⑶細胞因子與造血調控的研究；⑷植物有效成份抗白血病活性的研究；⑸造血干細胞移植的基礎和臨床研究。
除福建省血液病研究所外，我省部分地市級醫院也成立血液病研究機構，如三明市血液病研究所，泉州市第一醫院血液病研究室，漳州市立醫院血液病研究室等。目前各地市級以上醫院均有血液病專科醫生和專業病床，部分縣級醫院有血液病專科醫生。泉州市還成立了泉州市醫學會下的血液病專業委員會。
二、近年來福建省血液病學學科進展
下面就我省血液病學科的臨床與基礎研究進展概述如下:
(一)臨床研究
1.真性紅細胞增多癥
真性紅細胞增多癥是一種骨髓增殖性疾病，傳統治療方法主要有化療和放射治療，副作用大。由呂聯煌教授主持下應用三尖杉酯堿治療真性紅細胞增多癥，有很好的療效。五項指標（完全緩解率、達完全緩解中數時間，完全緩解持續時間、復發率、復發時間）全面對比，這種新療法優于目前國內外治療該病的其他療法，具有療效好、見效快、價格廉、副作用小、不誘發白血病等優點，是國際首創的，較理想的一種新療法。研究論著在中華內科雜志發表[1]，受到國內外同行專家的重視。法國醫學雜志轉載論文摘要，法國、美國等外國專家來信索取研究資料，美國醫生來信聯系有真性紅細胞增多癥病人因治療效果不佳，希望來中國住我院采用三尖杉酯堿治療。本研究成果已在國內推廣應用，許多醫療單位應用后同樣取得很好的療效，獲得明顯的社會效益和一定的經濟效益。該成果榮獲1987年國家科學技術進步獎。
2.再生障礙性貧血（AA）
再生障礙性貧血是造血系統“重癥”之一，近年，國內、國外學者對AA的認識較傳統觀念有了明顯進步,眾多研究表明細胞免疫異常是AA發病機制中的主要環節。免疫抑制治療是AA的主要治療方法。該類治療主要包括抗淋巴細胞球蛋白/抗胸腺細胞球蛋白(ALG/ATG)、環孢霉素（CSA）、腎上腺皮質激素類、大劑量靜脈人血丙種球蛋白、環磷酰胺及異基因骨髓移植前的預處理等。我省自上世紀九十年代將ATG/ALG用于治療SAA，現已成為AA（特別是SAA）主要的免疫治療手段。該類制劑治療AA的機制主要是抑制或破壞T淋巴細胞。ATG/ALG多不單用，可與CSA、雄激素、造血刺激因子合用。聯合方案有效率可高達50--60%左右，并有取代干細胞移植趨勢。
CSA是用于AA的另一種免疫抑制劑。CSA與ATG/ALG在AA治療上有互補作用，故聯用效佳。單用CSA加雄激素合用治療AA也有相當的療效，但起效慢。
除上述藥物治療外，我們也開展異基因造血干細胞移植治療AA，一些病人獲得痊愈，但開展例數尚少。
3.急性白血?。ˋL）
白血病病因仍不明確。對白血病病因學的研究，我省的呂聯煌教授領導的課題組首次發現我國有人類T細胞白血病病毒流行區及其傳染方式[2]，為防止這種致命的白血病病毒流行在全國蔓延擴大做出了貢獻，基因測序研究首次發現我國HTLV-1與國外報導不同，這一發現對了解HTLV-1感染源有重大意義，并有助于了解世界HTLV-1流行及分布特點，成果獲1997年國家科技進步獎三等獎及1998年萍科技獎二等獎。
由于白血病細胞起源、分化和生物學行為不同，構成了白血病的異質性，因此急性白血病的全面、正確分型是準確、及時治療的前提。隨著免疫學與生物學的進展及應用，急性白血病的診斷技術也有很大發展，國際血液病學家及血液病理學家于2001年3月在里昂會議上建議造血和淋巴組織腫瘤的WHO分類法，就是應用MICM方法力求反映疾病本質，成為國際上一種新的分類標準[3]。
為了與國際接軌,近年來省內也漸開展MICM分型方法,但目前尚待進一步完善中,已開展白血病融合基因檢測,用于臨床診斷。
急性髓細胞白血病(AML)治療主要是聯合化療、誘導分化、造血干細胞移植、免疫化療、基因靶向治療等。我們在臨床上對AML誘導治療一般采用標準誘導方案DA（3+7）或IA（3+7），≤60歲AML患者，CR可達75%～80%，OS約為30%;≥60歲AML CR率為40%～55%，OS為10%～15%,接近國際先進水平。為了提高CR率，我們也進行臨床試驗研究,如蒽環類藥增量，加大阿糖胞苷量，或加用其他化療藥物如VP-16、VM26、氟達拉賓、拓撲替康等，同時還可用預激方法（G-CSF、GM-CSF）促使白血病細胞進入細胞分裂周期等。 緩解后化療對＜60歲的AML患者有明顯療效。對于中危患者可用3～4個大劑量阿糖胞苷后進行異基因干細胞移植。對于高危AML患者在CR后應立即進行異基因干細胞移植。
急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）是AML中的一種亞型，臨床以出凝血異常導致的出血為特征，血象常表現為白細胞不高，骨髓中顆粒增多的異常早幼粒細胞增多，細胞遺傳學檢查有特異性改變，分子生物學可以檢測到早幼粒細胞白血病-維甲酸受體a（PML-RARa）融合基因。近十多年來對APL的研究取得較大進展，隨著從臨床到基礎、從基礎到臨床的不斷反復，化療、維甲酸、砷劑、新研發的分子靶向性藥物成為APL治療的4個里程碑，使得APL成為僅通過藥物即可能達到治愈的惡性血液病，同時分化誘導治療的成功也為其他腫瘤提供了一條新的思路[4]。在臨床上我們常規使用ATRA聯合亞砷酸治療APL，CR率大于90%，與國內外先進水平相仿。
急性淋巴細胞白血?。ˋLL）是一組生物學和預后不同的異質性疾病。近年來在分子生物學上的進展為臨床上根據細胞遺傳學特征更為準確地識別預后不同的ALL，并根據其危險度調整治療策略，使治療更加個體化和高效低毒。
我省成人ALL最常用的誘導緩解方案包括長春新堿、潑尼松、蒽環類、L-門冬酰胺酶和環磷酰胺(CTX)等。CR率達到80%～85%,中位緩解時間約為18個月,用地塞米松(DX)替代潑尼松,表現出更強的抗白血病活性和腦脊液中更高的藥物水平。上述聯合用藥方案已經能夠獲得相當高的緩解率,但強烈的誘導緩解可能會對疾病緩解時間和長期生存產生積極的影響，如在T-ALL加用Ara-C和CTX,在成熟B-ALL分次應用CTX和用大劑量甲氨喋呤(MTX)等。
鞏固治療包括改良的誘導緩解方案,序貫的鞏固治療方案和造血干細胞移植。目前的治療策略傾向于根據亞型和疾病危險分組調整鞏固治療方案，我們也參考國外強烈的化療方案HyperCVAD，分次給予CTX、大劑量Ara-C和MTX。
HLA匹配的相關供者的干細胞移植（SCT）已經被應用于治療各種類型的成人ALL。在CR1后用HLA相配的異基因SCT治療的生存率約為50%。
Ph+ALL發生率與年齡顯著相關，在ALL中總的發生率為20%～30%，隨年齡增長發生率增高，盡管60%的病例能獲得CR，但大多數病例會復發，其5年的DFS低于10%～20%。伊馬替尼是一種選擇性bcr-abl酪氨酸激酶抑制劑，用于治療Ph+ALL顯示出良好的應用前景。我們應用伊馬替尼治療復發和耐藥的Ph+ALL，能使其獲得血液學或骨髓反應，但其持續時間較短，很快發生繼發耐藥，這反映了其單藥治療的局限性，必須與其他藥物聯合應用以克服耐藥。
對于難治復發的白血病患者,我們吸收、應用國際上先進方案FLAG、CAG、B-NHL86等治療方法，白細胞去除術搶救高白細胞性急性白血病,也取得一些療效。
4.慢性粒細胞白血?。–ML）
慢性粒細胞白血病自從被描述至今已有一個半世紀之久，但治療進展十分緩慢，中位存活期3-4年。上世紀七十年代開創的異基因骨髓移植使CML患者有了治愈的可能。上世紀八十年代干擾素的應用是第一個可使少數CML慢性期患者獲得遺傳學緩解的藥物，但該藥對CML進展期無效，亦不能 防止急變且患者須長期接受注射，易受多種副作用困擾，耐受性差。直至上世紀末特異性、靶向性治療藥物-甲磺酸伊馬替尼的問世，才為CML的治療開創了新紀元[5]，超過三分之二的慢性期患者和少數加速期患者有獲得完全遺傳學緩解甚或主要分子生物學緩解的可能，提高患者的生存質量。特別是使急變期患者轉變為慢性期，獲得機會去做異基因干細胞移植而長期生存?，F在伊馬替尼已在我省廣泛應用于慢粒治療,取得明顯效果。也有相當一部分病人接受異基因造血干細胞移植而治愈。
5.慢性淋巴細胞白血?。–LL）
慢性淋巴細胞白血病是一種B淋巴細胞腫瘤。根據WHO的定義，CLL與小淋巴細胞淋巴瘤（SLL）同屬一種疾病，是SLL的白血病表現形式。過去所謂的T-CLL現歸屬于T細胞幼淋巴細胞白血病。在我國，CLL僅占白血病的4.6%。
CLL的分期對判斷患者的預后和決定何時開始治療有重大意義。Rai分期法和Binet分期法根據淋巴結、肝脾腫大情況和紅細胞、血小板的減少程度將CLL作了分析，指導臨床治療，沿用多年。但是，僅依靠臨床表現的分期，不能準確預測哪些低?；颊叩募膊M展。據文獻報告，ZAP-70（Zeta鏈相關蛋白-70）和CD38等檢查結果有助于預測疾病活動程度。從今年開始,我省對慢淋病人進行ZAP-70和CD38檢測,以指導治療。
治療方案的選擇：首選治療方案以嘌呤類似物為主，如氟達拉濱、氟達拉濱+美羅華等；也可選用經典的瘤可寧+強的松或COP及干擾素治療。
6.惡性淋巴瘤
我國報告的惡性淋巴瘤絕大多數為非霍奇金淋巴瘤(NHL),HL不足10%。在NHL中,中高度惡性淋巴瘤所占比例又高達80%以上。由于淋巴瘤中存在TCR和IgH基因重排,PCR可以區別反應性增生淋巴結病還是惡性淋巴瘤。淋巴瘤分型也因此由病理、免疫發展到核型和分子病理學分型的階段。治療上除應用傳統的化、放療外,還采用氟達拉濱、針對CD20靶向免疫治療藥物-美羅華等新療法[6]，提高療效。自體骨髓移植和異體造血干細胞移植治療惡性淋巴瘤,不僅使許多病例延長了生存期,而且使其中部分病例獲得治愈。對于療效的監測，我們也應用最先進的PET-CT影像學技術定期隨訪病變情況。
7.多發性骨髓瘤（MM）
多發性骨髓瘤是漿細胞的惡性腫瘤。如不進行治療，進展期MM患者的中位生存期僅為6個月。常規化療的治療有效率為40%~60%，完全緩解率低于5%，中位生存期不超過3年。約25%的患者能存活5年以上，存活10年的MM不到5%。對于新診斷的多發性骨髓瘤患者,我們采取MP,VAD加沙利度胺等方案治療,相當部分的病人病情控制穩定。近幾年來隨著對MM生物學特性的深入研究，形成了新的治療思路，著眼于MM細胞內信號通路，骨髓微環境及二者的相互作用，涌現出一批新的靶向藥物如蛋白酶抑制劑萬珂，與傳統化療以及造血干細胞移植等治療手段的聯合極大地提高了MM治療的有效率，特別是CR率，但在我省只有個別病例使用，尚待更多的臨床療效觀察。
8.骨髓增生異常綜合征（MDS）
骨髓增生異常綜合征是一組起源于造血干細胞的獲得性克隆性疾患，其特征性病理改變是克隆性造血干/祖細胞發育異常和無效造血，其基本臨床特征是骨髓中造血細胞有發育異常的形態學表現和外周血中血細胞減少，轉變為急性髓性白血病的危險性很高。2001年，WHO頒布造血組織和淋巴組織腫瘤新的分類方案中將MDS的診斷分型與1982年FAB標準相比做了一些修訂,特別是將MDS和AML骨髓原始細胞的分界降低為0.20，取消了RAEB-t亞型。MDS的治療對于大多數病程平穩，主要表現頑固性血細胞減少，而基本上沒有惡性表征的患者，治療目標應是提高血細胞數量和保持較好的生活質量。我們在臨床上主要采用小劑量阿糖胞苷等的誘導分化治療和支持治療。
9.特發性血小板減少性紫癜（ITP）
特發性血小板減少性紫癜是一種免疫介導的血小板減少綜合征，是臨床最常見的出血性疾病，約占出血性疾病總數的30%。ITP為自身免疫性疾病，目前尚無根治的方法，治療上主要采用免疫療法。治療的目的是使患者的血小板計數提高到安全水平，防止嚴重出血，降低病死率；而不是使患者的血小板計數達到正常。潑尼松仍是ITP一線治療藥物，大劑量地塞米松也在臨床取得滿意的效果。應用大劑量地塞米松時，應注意檢測血壓、血糖的變化，并注意預防感染，保護胃粘膜。大劑量靜脈用丙種球蛋白也在臨床上用于搶救重型ITP患者。
10.造血干細胞移植的進展
自上世紀60年代造血干細胞移植應用于臨床開始，移植技術不斷進步，日趨成熟，亦更為安全有效，已經成為治愈各型白血病、淋巴瘤等惡性血液病及再障、某些實體瘤、自身免疫性疾病及部分遺傳性疾病的有效方法。
異基因造血干細胞移植中有近85%是同胞全相合異基因造血干細胞移植（Allo-HSCT），是目前應用最多也是最為成熟的異基因移植方式。單倍型HSCT和非清髓HSCT在臨床上也有開展。
我省首例造血干細胞移植于1990年由福建醫學院附屬協和醫院開展，當時對一名急性淋巴細胞白血病青年行自體骨髓移植成功，之后福州總醫院，福建醫科大學附屬第一醫院，福建省腫瘤醫院，泉州市第一醫院，三明市第一醫院，龍巖市第一醫院，廈門市第一醫院相繼開展自體造血干細胞移植。異基因造血干細胞移植在此基礎上也迅速開展。1996年，福建省腫瘤醫院首先開展外周血干細胞采集，并開展自體外周血干細胞治療實體瘤。2000年，福建醫科大學附屬協和醫院與福建省腫瘤醫院合作，開展異基因外周血干細胞移植治療慢性粒細胞白血病，此例移植后至今仍然在工作崗位上。此后在福州總醫院、福建醫科大學附屬第一醫院、泉州市第一醫院、廈門市中山醫院、漳州市醫院均相繼開展異基因外周血干細胞移植，病種覆蓋急慢性白血病、惡性淋巴瘤、急性再生障礙性貧血和陣發性睡眠性血紅蛋白尿等。2002年，福建醫科大學附屬協和醫院開展我省首例非親緣造血干細胞移植治療慢性粒細胞白血病，之后非親緣造血干細胞移植治療血液系統惡性腫瘤相繼在廈門市中山醫院和泉州市第一醫院開展。2004年起，福建醫科大學附屬協和醫院開展供者淋巴細胞輸注治療骨髓移植后復發的白血病的研究。
我省自體造血干細胞移植例數超過150例，除應用于血液系統惡性腫瘤外，還包括風濕病等自身免疫性疾病。異基因外周血造血干細胞移植例數超過120例,非親緣造血干細胞移植18例。我省也積極參與中華骨髓庫的資料登記,已外送非親緣造血干細胞21例。龍巖市第一醫院開展造血干細胞移植治療血栓閉塞性脈管炎取得良好療效。
(二)基礎研究
1.基因治療研究:主要開2個主要方面的研究,即核酸藥物及免疫基因治療。重點開展抗癌基因新藥反義核酸的研究，設計和研制成功抗癌基因新藥Bcl-2反義核酸，藥效學研究發現它對白血病和惡性淋巴瘤裸鼠移植瘤有良好的療效，單獨應用時能誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長，與化療藥物聯合應用時，能逆轉腫瘤對化療藥物的耐藥性，提高治療效果。并進行ASODN臨床前的藥效學、藥代動力學及毒理學實驗，是國內最早開展抗癌基因藥物反義核酸的研究單位之一，"Bcl-2反義硫代磷酸寡脫氧核苷酸對白血病細胞系基因治療的系列研究"獲2000年省科技進步三等獎。RNA干擾（RNAi）是1998年以來發現和發展起來的一門新興的基因阻斷高新技術，小干擾RNA（siRNA）代替反義核酸進行轉錄后基因沉默，已經應用到基因功能和基因治療研究中。我科在開展反義核酸研究的基礎上，正在開展siRNA的設計、研制和抗腫瘤效應研究。同時開展抗bcr/abl融合基因核酶對慢性粒細胞白血病基因治療及自體骨髓凈化研究，有望用于CML自體骨髓移植的體外凈化，并對野生型p53基因誘導白血病細胞分化凋亡的機制進行研究。
基因免疫治療方面的研究有基因瘤苗治療淋巴瘤和白喉毒素真核表達載體構建及其對B細胞惡性腫瘤的選擇性殺傷作用的研究，取得了較好的實驗結果，成功地構建了含Igκ輕鏈基因啟動子/增強子抗百咳毒素A鏈基因的真核表達載體，轉染表達Igκ輕鏈腫瘤細胞（CA46細胞），發現其能特異性抑制CA46細胞增殖。還應用基因工程技術，制備GM-CSF和B7.1基因修飾的淋巴瘤細胞瘤苗，它能有效地激發親本小鼠抗淋巴瘤免疫反應，具有潛在的臨床應用價值，有望用于清除淋巴瘤微小殘留病。以上這些研究總體居國內先進水平，有些為國內率先開展、報告。
2.開展細胞因子與造血調控的研究:主要涉及以下幾方面：①血小板反應蛋白（TSP）以及類肝素物質對巨核細胞生長的作用及其機制；②正常血細胞分化各階段及各個類型白血病細胞的細胞因子及其受體表達的研究；③急性白血病TGFβ1水平的變化及意義；④外源性TGFβ1、wt-p53、全反式維甲酸、三氧化二砷調控白血病細胞因子和受體以及bcl-2、c-myc、端粒酶活性表達及其與白血病細胞分化、凋亡的關系；⑤TGFβ1、TNFα、反義寡脫氧核苷酸對白血病細胞凋亡和造血干細胞體外擴增的影響。取得如下結果：①在國際上首次發現TSP是巨核細胞生成的負調控因子并發現其功能基團，類肝素物質-藻酸雙酯鈉對CFU-MK的形成具有刺激作用；②CD34+造血干細胞表達多種正性細胞因子及受體，隨著細胞分化成熟，正性細胞因子表達逐漸減少，而負性細胞因子TGFβ1、TNFα則持續存在；③白血病細胞亦可同時表達多種正性細胞因子，但作為最強的負性細胞因子TGFβ1在急性白血病的表達水平低于正常人，急性白血病緩解后，TGFβ1水平恢復正常，復發患者其TGFβ1水平又趨降低，并發現原代急性白血病細胞存在TGFβ1Ⅱ型受體異構體。說明白血病細胞存在正、負細胞因子失衡；④全反式維甲酸、wt-p53、三氧化二砷誘導白血病細胞分化凋亡過程中，伴有內源性TGFβ1、TNFα表達上調，bcl-2、c-myc表達下調，端粒酶活性下降，而反義TGFβ1、TNFα寡脫氧核苷酸能夠阻斷細胞凋亡的發生，并使bcl-2表達水平恢復，提示內源性TGFβ1、TNFα是促進白細胞分化的內在動力。⑤TGFβ1、TNFα反義寡脫氧核苷酸可提高CD34+造血干細胞數量和CFU-GEMM集落數，提示阻斷內源性TGFβ1、TNFα可能是造血干細胞體外擴增的有效途徑之一。
上述研究成果多為國際上首先報道，豐富了造血及白血病的基礎理論知識，系列研究在《Br. J. Hematol》[7]、《J Lab Clin Med》等刊物上，并在國際學術會議上做報告。
3.開展植物有效成分治療白血病的研究:這方面有較好基礎，是國內最早開展三尖杉酯堿治療白血病研究的單位之一，獲得全國科學大會獎；并設計以三尖杉酯堿為主的HOAP方案治療急性白血病，還在國際上首創三尖杉酯堿治療真性紅細胞增多癥新療法，獲國家科技進步三等獎。我們在國際上率先開展了雷公藤內酯醇治療白血病的實驗、臨床研究以及姜黃素治療白血病及淋巴瘤的實驗研究，取得了一系列創新性成果。雷公藤內脂醇與多種抗癌藥物具有協同作用，能逆轉白血病細胞的耐藥性，其抗癌機制可能是通過抑制白血病細胞bcl-2的表達并激活Caspase-3而發揮作用。它還可通過下調Ras/Raf/MEK/Erk途徑的信號傳導，最終減少轉錄因子c-Jun的含量而抑制細胞的增殖。在相關實驗研究基礎上，首次進行雷公藤內酯醇（國產抗腫瘤一類新藥）Ⅰ~Ⅱ期臨床研究，發現該藥具有良好的抗白血病作用，有望成為一種抗白血病的新藥。本學科還通過從天然植物姜黃中提取姜黃素，研究姜黃素對慢粒細胞系K562細胞的抗癌活性及其對酪氨酸激酶的影響，結果表明姜黃素可特異性下降P210蛋白的表達，抑制其激活的Ras信號途徑，從而抑制細胞增殖；引起國內外的關注，其中"姜黃素的抗癌活性及其對癌細胞周期與信號轉導的影響"獲得由歐洲腫瘤學會、中國癌癥研究基金會聯合頒發的2001'DEBIO-CCRF中國獎，相關研究還獲省科技進步二等獎，并獲中國專利1項。此外，進行姜黃素對HL60細胞及CA46細胞的抗癌活性研究，發現姜黃素能通過下調c-myc、bcl-2、突變型P53及上調Fas的表達而抑制HL60細胞和CA46細胞增殖，誘導細胞凋亡。目前正在擴大姜黃素對惡性血液病治療的實驗研究，如對多發性骨髓瘤細胞株U266的作用，初步研究結果顯示其對骨髓瘤細胞有增殖抑制作用并誘導細胞凋亡，其機制目前正在研究中。由于姜黃素對正常細胞毒性低，因而是一種很有開發前景的抗白血病新藥，該研究課題獲國家教育部資助，并是福建省自然科學基金重大項目課題，目前我們還研究該藥抗白血病的分子機制，上述研究已產生或將產生明顯經濟及社會效益。
其他正在研究的植物單體成份還有大黃素等，同樣也有類似的抗白血病效應。
4.開展骨髓凈化的實驗研究:系統研究了烷化溶血磷脂（ALP）對急慢性白血病骨髓的凈化作用，采用ALP和Bcl-2反義核苷酸提高凈化療效。針對慢性粒細胞白血?。–ML）自體骨髓移植效果差的問題，研究了CML自體樹突狀細胞活化的骨髓細胞凈化CML骨髓，結果表明對Ph陽性CML有肯定的凈化效果。還在國際上首先研究光敏劑ZnPc-PDT對正常造血細胞的影響及對白血病細胞的殺傷作用，同時對模擬緩解骨髓中K562細胞的凈化作用也作了研究，并在體外研究其凈化效果及對HL60細胞的體內殺傷作用，進而聯合ZnPc-PDT與免疫瘤苗治療小鼠淋巴瘤。研究表明ZnPc-PDT具有體內外抗血液腫瘤細胞的作用，對體外實驗時正常MNC中摻入的K562細胞及體內實驗時骨髓移植物中摻入的EL9611細胞有較好的凈化作用，與免疫瘤苗聯合發揮顯著的抗淋巴瘤效應，為ZnPc-PDT應用于治療血液腫瘤臨床提供了實驗依據。在惡性血液病的免疫治療方面，采用供者淋巴細胞輸注聯合小劑量化療治療骨髓移植后復發的白血病，觀察到一定的治療效果，為進一步深入開展白血病的過繼免疫治療打下基礎。應用烷化溶血磷酯反義技術、樹突狀細胞及信號傳導阻滯劑用于白血病骨髓凈化的研究已經得取了階段性成果，并繼續深入研究中。
三、教學及學術交流
分會積極培養高層次人才，掛靠單位福建醫科大學附屬協和醫院、福建省血液病研究所創建基因工程實驗室，引進先進的分子生物學儀器設備，開展高水平的科研工作，使學科具備較強的科研實力和較高的學術水平，部分研究成果具有國內領先和國際水平，1982年成為福建醫科大學臨床醫學碩士點，1990年成為福建醫科大學第一個臨床醫學博士點，2001年經國家批準為福建醫科大學臨床醫學博士后科研流動站，已培養博士生40名，碩士生77名。
分會在積極培養高層次人才同時，不忘為我省培養年輕醫師，組織培養全省各級進修、輪轉及通科培訓人員。承擔福建醫科大學醫療系、口腔系、檢驗系、預防醫學系、高護系、麻醉系、影像學系、美容、衛管、全科等各專業本科、醫專班以及成人教育班的診斷學、內科學、臨床醫學概論、臨床血液學及實驗血液學的教學工作，包括上大課、實驗課，同時還承擔醫學系、檢驗系的臨床見習教學及實習指導任務。認真抓好教學工作，經常進行教學查房、?？浦v座、技能操作培訓，為實習及見習同學創造良好環境。
分會積極組織開展省內、國內及國際學術交流活動，邀請國外專家舉行專題講座，分會委員參加國際血液病學術會議，赴國外學術機構進修學習。為提高學科專業技術水平與促進學科發展，定期開展全省血液病學術交流活動，疑難病例討論會，至今共召開了十一次全省血液病學學術會議，承辦了3次全國性血液病學學術研討會。
雖然分會近年來取得了一些成績和進展,但與國內外先進機構相比還有相當差距,今后更要努力加快工作,發揮優勢,爭取趕上國內外先進水平。
參考文獻:
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[2]呂聯煌,等．福建省沿海地區人類T淋巴細胞白血病病毒小流行區的發現．中華血液學雜志1989,10:225.
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[5]Savage DG,et al.Imatinib mesylate: a new oral targeted therapy. N Engl J Med 2002,346:683.
[6]Czuczman MS,et al.Treatment of patients with low-grade B-cell lymphoma with the combination of chimeric anti-CD20 monoclonal antibody and CHOP chemotherapy. J Clin Oncol 1999,17:268.
[7]Yuanzhong Chen, et al. Interleukin-3 is an autocrine growth factor of human megakaryoblasts ,the DAMI and MEG-01 cells. Br J Haematol 1994,88:481.
課題組成員：
1.胡建達: 教授，主任醫師，博士生導師,福建省血液病研究所副所長
2.楊鳳娥:福建省血液病研究所主任醫師
