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2011-06-09收稿；2011-09-04接受
本文系寧夏自然科學基金（No. NZ1147）資助項目
* E-mail: gaozn@nxu.省略
1 引 言
延胡索酸泰妙菌素（Tiamulin fumarate, TF）是一種半發酵半合成雙萜類新型動物專用抗生素（結構式見圖1），它通過抑制微生物核糖體內感受性細菌蛋白的合成，達到抗菌作用[1]。關于延胡
圖1 泰妙菌素的結構式
Fig．1 Structure of tiamulin
索酸泰妙菌素的研究已報道的有反相高效液相色譜法（RP-HPLC）[2]、高效液相色譜法（HPLC）[3]、液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）[4]、液相色譜-二極管陣列紫外光譜-串聯質譜聯用技術（LC-DAD-ESI-MS）[5]和電化學方法[6,7]。而在電化學方法中主要集中在碳糊電極[6]和修飾碳糊電極[7]上的電化學研究，但TF在乙炔黑-離子液體復合修飾玻碳電極上的電化學行為、電化學動力學及電化學分析方法研究工作尚未見報道。
乙炔黑具有良好的電子傳導性、較大比表面積和較強吸附能力等特性[8]，故被用于化學修飾電極修飾劑[9]。室溫離子液體（RTIL）是指室溫及鄰近室溫下完全由陰、陽離子組成的液體物質[10]，具有電位窗口寬，生物相容性好和離子導電性高，能促進電子傳遞等特點[11]，因此引起了電化學工作者的極大興趣。
本實驗在前期工作[6,7,12～14]基礎上，將1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽 （[BMIM]PF6） 與AB混合, 制備了乙炔黑-離子液體復合修飾玻碳電極（AB-ILs/GCE），研究了TF在AB-ILs/GCE上的電化學行為及電化學動力學性質，并建立了TF含量的電化學定量測定方法。2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
CHI660A電化學工作站（美國CHI儀器公司）；電化學測定采用三電極系統：以CHI104 GCE （美國CHI儀器公司）和AB-ILs/GCE為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，CHI115鉑絲為輔助電極。
圖2 不同電極的電化學阻抗譜圖
Fig．2 Electrochemical impedance spectrum of acetylene black-ion liquid modified glassy carbon electrode （AB-ILs/GCE） （a）, AB/GCE（b） and GCE（c） in a mixture of 1.0 mmol/L K3Fe（CN）6-1.0 mmol/L K4Fe（CN）6 solution. Supporting electrolyte: 0.10 mol/L KCl. The frequency range is 0.1～105Hz.
TF原料藥（寧夏多維泰瑞制藥有限公司，批號：201005041）；TF注射液（贛州百靈動物藥業有限公司，批號：080402）；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIM]PF6，純度99%， 上海成捷化學有限公司）；實驗用水均為二次蒸餾水。
電化學測試前于電解池中通入高純氮除氧5 min。本研究所涉及到的電位均為相對于SCE的電極電位，所有電化學測試均在室溫下進行。
2.2 AB-ILs/GCE制備及電化學阻抗譜表征
GCE先用0.3
SymbolmA@ m α-Al2O3 拋光至鏡面，用水沖洗干凈。再分別在丙酮和水中超聲清洗2 min， 以除去殘留氧化鋁粉，晾干備用。準確稱取8 mg AB并用微量取樣器移取15
SymbolmA@ L [BMIM]PF6，將二者在研缽中混合研磨約20 min，得到糊狀物，取少許糊狀物均勻涂敷在已處理好的電極表面， 制得AB-ILs/GCE。電化學阻抗譜可表征電極表面修飾過程中電阻變化信息[15]。以1.0 mmol/L Fe（CN）63
Symbolm@@ /4
Symbolm@@ 為電化學探針對GCE （圖2c），AB/GCE（圖2b）和AB-ILs/GCE（圖2a）進行了電化學阻抗譜測試。由圖2a可知，AB-ILs/GCE在高頻區出現半圓?。ò雸A弧直徑代表電荷轉移電阻），且其電荷轉移電阻明顯小于AB/GCE和GCE的電荷轉移電阻，表明AB-ILs/GCE上有著較高導電性及較小的電荷轉移電阻；而在低頻區AB-ILs/GCE的直線斜率遠大于AB/GCE和GCE的直線斜率，說明在AB-ILs/GCE上電活性物質從溶液擴散到電極表面的電阻減小，擴散速率加快[16]。
3 結果與討論
3.1 TF伏安行為
在0.10 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 （PBS, pH 6.8），掃描速度50 mV/s及電位窗口0.0～1.2 V的條件下，采用CV研究了1.0
SymbolmA@ mol/L TF在GCE（圖3c），AB/GCE（圖3b） 圖3 TF的循環伏安圖
Fig．3 Cyclic voltammograms of 1.0×10
Symbolm@@ 6mol/L tiamulin fumarate （TF） at GCE （c）, AB/GCE（b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS. Scan rate: 50 mV/s及AB-ILs/GCE（圖3a）上的伏安行為。如圖3c所示，TF在GCE上于0.74 V 處出現一個不可逆氧化峰，氧化峰電流為2.847
SymbolmA@ A；TF在AB/GCE上亦于0.74 V處出現一個不可逆氧化峰，氧化峰電流為4.386
SymbolmA@ A。與GCE相比，TF在AB/GCE的氧化峰電位基本不變，氧化峰電流增大約1.8倍；比較曲線a和曲線b發現，TF在AB-ILs/GCE的氧化峰電位略有負移，氧化峰電流增大約3倍。此結果表明，TF電催化氧化反應是一個不可逆電極反應過程，且AB-ILs/GCE對TF電催化氧化具有良好的催化作用。這可能是由于乙炔黑具有較大的比表面積，為TF的電催化氧化提供了較多的反應位點，加速了TF電子交換速率[8]；另外，離子液體的高離子導電性也能夠進一步促進電子傳遞[11]。兩者的協同作用使AB-ILs/GCE對TF的電化學氧化具有更好的催化作用。在10～400 mV/s范圍內，采用CV研究了掃描速度對TF在AB-ILs/GCE上伏安行為影響。實驗表明，隨掃描速度增加, TF在AB-ILs/GCE氧化峰電位Epa發生正移，峰電流Ipa增大，且峰電流Ipa與掃描速度平方根（v1/2）呈良好線性關系，擬合方程為Ipa（
SymbolmA@ A）＝
Symbolm@@ 1.378＋2.778v1/2，R＝0.9962。該結果表明，TF在AB-ILs/GCE上電化學氧化是受擴散步驟控制的電極反應過程。
3.2 實驗條件的影響
在電位窗口0.0～1.2 V，50 mV/s掃描速度下，分別以0.10 mol/L的KCl，Na2SO4，NaClO4，Na2HPO4-NaH2PO4（PBS, pH 6.8），NaAc-HAc，B-R （Britton-Robinson） 等為支持電解質，對5.0×10
Symbolm@@ 5 mol/L TF進行CV測試。實驗表明，在PBS中TF具有良好電化學行為，因此選用PBS為支持電解質。
在pH 2.0～9.5 范圍內考察了介質pH對TF伏安行為的影響。實驗表明，在pH 2.0～8.0范圍內Epa隨pH值增大而負移，其線性方程為Epa＝
Symbolm@@ 1124.60
Symbolm@@ 55.67（mV/pH），R＝0.9985。依據Ep（mV）＝E.0
Symbolm@@ （59m/n）/pH 得到m/n≈1；已知n＝2[7]，由此計算得到質子參與數m＝2，即TF在AB-ILs/GCE上電化學氧化過程是2個電子2個質子參與的不可逆電化學氧化過程；在pH 8.0～9.5范圍內， Epa隨pH值增加而基本不變。而在pH 2.0～6.0范圍內， 氧化峰電流Ipa隨pH值增加而降低； 在pH 6.0～9.5范圍內， Ipa基本不變。
3.3 電化學動力學
3.3.1 電荷轉移系數α 根據上述實驗結果，以Epa對logv作圖，得到GCE及AB-ILs/GCE上Epa-logv關系，其線性方程分別為Epa （mV）＝63.62 logv＋635.4 （R＝0.9986），Epa （mV）＝149.0 logv＋551.3，（R＝0.9987）。斜率分別為63.62和149.0 mV。
根據完全不可逆擴散控制過程方程式[17]：
Ep＝（blogv）/2＋C（1）
式中， C為常數， b為Tafel斜率，b＝2.3RTn（1
Symbolm@@ α）F。 由Epa-logv關系直線斜率可得b/2，即：b＝2
SymbolvB@ Ep
SymbolvB@ （logv） ， 已知n＝2[7]，因此計算得到α分別為0.77和0.90。
3.3.2 電極反應速率常數kf
平板電極上可逆電化學反應的電流響應遵循如下關系式[18]:
I（t）＝nFAkfC（1
Symbolm@@ 2Ht/π）（2）
H＝kfD1/2Ox＋kbD1/2Rd（3）
對于完全不可逆電極反應，kb＝0，H＝kf/D1/2Ox，采用CA可以測得電極反應速率常數kf。由實驗測得TF在GCE及AB-ILs/GCE上的I（t）-t1/2關系曲線 圖4 穩態電流-時間曲線
Fig．4 Time-dependent steady state currents obtained at AB-ILs/GCE while increasing TF concentration at 0.80 V with a stirring rate of 100 r/min截距分別為5.85×10
Symbolm@@ 4 及 3.21×10
Symbolm@@ 4，計算得到TF在GCE及AB-ILs/GCE上的電極反應速率常數kf分別為8.87×10
Symbolm@@ 2和1.23×10
Symbolm@@ 1s
Symbolm@@ 1。
在相同實驗條件下，利用穩態電流-時間響應曲線方法測定了TF在AB-ILs/GCE上的響應電流與濃度關系（圖4），TF電流響應信號隨其濃度成比例增長，響應時間小于5 s。最低響應濃度為0.2
SymbolmA@ mol/L。本方法檢出限低，靈敏度高，可作為TF電化學定量測定方法。
3.4 電分析方法的應用
3.4.1 TF方波伏安行為 在電位窗口0.0～1.2 V及優化了的方波實驗條件 （優化方波實驗條件：振
圖5 TF方波伏安圖
Fig．5 Square wave voltammogram （SWV） of 1.0
SymbolmA@ mol/L TF at the at GCE （c）, AB/GCE （b） and AB-ILs/GCE （a） in 0.10 mol/L PBS
幅45 mV，方波頻率5 Hz，電勢增量6 mV） 下對1.0
SymbolmA@ mol/L TF進行SWV測試，得到TF 在GCE，AB/GCE及AB-ILs/GCE上的SWV曲線（圖5）。TF在GCE上于0.70 V處出現一個不可逆氧化峰（圖5c），TF在AB/GCE上亦于0.70 V處出現一個不可逆氧化峰（圖5b）。與GCE相比，TF在AB/GCE氧化峰電位不變，氧化峰電流增大約2倍。比較圖5a與圖5b發現， TF在AB-ILs/GCE上氧化峰電位與AB/GCE上氧化峰電位相比略有負移，氧化峰電流增大2.1倍。此實驗結果與循環伏安法所得結果基本一致，進一步表明AB-ILs/GCE對TF電化學氧化具有良好的催化作用。
3.4.2 電極重現性和穩定性 同一支AB-ILs/GCE電極于5.0×10
Symbolm@@ 5 mol/L TF溶液CV掃描10次，其氧化峰電流RSD為1.9%；平行修飾6次RSD為2.9%，表明制作的修飾電極有良好的重現性。電極在室溫下放置48 h對， TF響應電流的變化量在±5%以內，表明該電極具有較好穩定性，電極壽命為30 d。
3.4.3 干擾實驗 在相同實驗條件下，TF濃度為5.0×10
Symbolm@@ 5 mol/L， 考察了常見離子和葡萄糖、蔗糖對TF催化氧化峰電流影響。實驗結果表明，1000倍無機離子K.＋，Na.＋，SO2
Symbolm@@ 4，Cl.
Symbolm@@ ，NO.
Symbolm@@ 3和50倍酒石酸、檸檬酸、葡萄糖、蔗糖對TF電流響應信號無干擾。
3.4.4 線性范圍及檢出限 在相同實驗條件下用SWV研究了TF氧化峰電流Ipa隨其濃度變化關系。實驗結果表明，TF氧化峰電流Ipa與其濃度在0.8～20
SymbolmA@ mol/L范圍內呈良好線性關系，線性方程為Ipa（
SymbolmA@ A）＝0.74＋0.23C（
SymbolmA@ mol/L）， R＝0.9973；檢出限（S/N＝3）為7.6×10
Symbolm@@ 8 mol/L。
3.4.5 實際樣品測定 取市售延胡索酸泰妙菌素注射液5支，混勻，取適量該溶液置于100 mL容量瓶，用水定容。運用SWV方法對此溶液進行測定，加入已知量TF標準品進行回收率測定，測定結果見表1。
表1 TF注射液中TF含量及回收率測定結果（n＝6）
Table 1 Determination results of TF in injection samples（n＝6）
樣品
Samples標示量
Labeled測得值
Found（mg）RSD（%）加入量Added（mg）測得值Found（mg）回收率Recovery（%）
1230.125 mg/支（ampoule）0.1252.20.0630.189101.8
0.1271.10.0750.20198.6
0.1272.90.0880.21599.7
由表1可知，所測得TF樣品的相對標準偏差在1.1%～2.9%，加標回收率在98.6%～101.8%之間，表明本方法精密度和準確度符合定量測定要求。 結果表明，TF電催化氧化是受擴散步驟控制的電極反應過程，且AB-ILs/GCE對TF的電催化氧化具有良好的電催化作用。同時測定了電極過程動力學參數，據此建立了TF電化學定量測定方法。
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Electrochemical Behaviors and Electrochemical Determination of
Tiamulin Fumarate at Acetylene Black-Ionic Liquid
Modified Glassy Carbon Electrode
CHEN Ji-Wen.1, DUAN Cheng-Qian1,2, GAO Zuo-Ning1,CHEN De-Gang.3
.1（Key Lab of Energy Source and Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering,
Ningxia University, Yinchuan 750021， China）
.2（Higher Vocational College, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004， China）
.3（Duowei Tairui Pharmacy Limited Company, Yinchuan 750004， China）
Effect of Aminopeptidase Inhibitor on Differentiation Induction Activity of All-trans Retinoic Acid in Human Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells and Its Mechanism
Abstract
This study was purposed to investigate whether aminopeptidase inhibitor，bestatin，can potentiate all-trans retinoic acid (ATRA)-inducing differentiation in NB4 cells，and to explore its mechanism. The NB4 cells were exposed to either bestatin and ATRA alone or in combination，the morphological changes of NB4 cells were observed by optical microscopy，the CD11b expression was measured by flow cytometry，the function of defferentiation cells was analyzed by nitroblue-tetrazolium (NBT) reduction assay，the mRNA expressions of c-myc and c-EBPε in NB4 cells were detected by RT-PCR，the c-Myc protein expression was determined by Western blot. The results showed that treatment with bestatin alone induced no significant changes in morphology，NBT reduction activity and CD11b expression in NB4 cells. NB4 cells incubated with 10 nmol/L ATRA plus 100 μg/ml bestatin showed more morphologic feature of metamyelocyte and band neutrophil than ATRA alone treated cells. 100 μg/ml bestatin enhanced the NBT reduction activity in NB4 cells induced by various concentrations of ATRA (10，20，40 nmol/L). The effects of various concentrations of ATRA in combination with 100μg/ml bestatin were statistically different from the effect of ATRA alone (P
Key words bestatin; ATRA; cell line，NB4; differentiation
氨肽酶抑制劑烏苯美司（bestatin）能抑制氨肽酶N/CD13和亮氨酸氨基肽酶活性，通過增強宿主免疫功能及誘導腫瘤細胞凋亡等發揮抗腫瘤作用［1，2］。有研究提示，bestatin能夠誘導U937細胞的分化［1］，國內未見報道。我們以NB4細胞為研究對象，通過形態、功能和表面分化抗原等多層次實驗研究，了解bestatin是否能誘導NB4細胞分化及（或）對ATRA的誘導分化作用的增強效應，并初步探討其可能的機理。
材料和方法
主要試劑
Bestatin、ATRA均購于Sigma公司。bestatin以無菌去離子水溶解為1 mg/ml，分裝之后-20℃保存；ATRA以無水乙醇溶解成10-5 mol/L的儲存液，4℃避光保存，使用時用RPMI 1640細胞培養液將其稀釋為相應工作濃度。NBT為BBI公司產品，以PBS配成0.1%溶液，過濾除菌后4℃避光保存，使用前1周內配制。RPMI 1640為Gibco公司產品。胎牛血清為JRH公司產品。CD11b-FITC標記單克隆抗體為Teotech公司產品。CD13-PE標記單克隆抗體為Becton Dickinson公司產品。TRIzoL試劑為Gibco公司產品，M-MLV逆轉錄酶和Taq DNA合成酶為Promega公司產品。鼠抗人c-Myc單克隆抗體（c-33）及羊抗人β-Actin多克隆抗體（I-19）均為Santa Cruz公司產品，使用時以TBST液分別按1∶500和1∶1 000稀釋。ECL顯色液為Santa Cruz公司產品。
細胞培養及藥物處理
人APL細胞株NB4細胞（浙江大學腫瘤研究所惠贈）及人髓細胞白血病細胞株HL-60細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養液中，置37℃、5% CO2培養箱中培養，2-3天傳代1次。實驗時取對數生長期的細胞，調整細胞密度為7×104/ml，以不同濃度ATRA和bestatin單獨或聯合處理，于不同時間收集細胞進行實驗。
細胞形態學觀察
取空白對照組及藥物處理各組細胞懸液，離心，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，用光學顯微鏡（Leica，40×10）觀察細胞形態。
四氮唑藍（nitroblue-tetrazolium，NBT）還原實驗
按文獻［3］報道的方法進行?？瞻讓φ战M及藥物處理各組細胞與NBT共孵育后，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，光學顯微鏡下（100×10）觀察，胞漿內含有藍黑色顆粒者為陽性細胞，隨機計數200個細胞，計算陽性細胞百分率。
細胞表面分化抗原CD11b和CD13的檢測
取對數生長期HL-60細胞和NB4細胞或藥物處理后各組NB4細胞離心，用PBS（pH 7.4）洗滌，調整細胞數為2×105/50 μl，加CD13-PE標記單克隆抗體8 μl或CD11b-FITC標記單克隆抗體5 μl，避光孵育30分鐘，用PBS洗滌，上流式細胞儀檢測。以Cellquest 1.2軟件進行分析。
細胞總RNA提取和RT-PCR反應
總RNA提取 用TRIzoL一步法抽提細胞總RNA，按試劑說明書操作。甲醛變性凝膠電泳證實為完整RNA，紫外分光光度儀定量，A260 nm/280 nm比值均在1.8-2.0之間。
逆轉錄反應
樣品總RNA 4 μg及隨機引物0.5 μg，70℃ 5分鐘，立即冰浴，離心。依次加5×逆轉錄酶緩沖液5 μl、10 mmol/L dNTP 1.25 μl、M-MLV 200 U，RNase抑制劑0.6 μl，DEPC水補至反應體積為25 μl，于27℃10分鐘，37℃ 60分鐘，72℃ 10分鐘滅活逆轉錄酶，冰浴1分鐘，結束反應。
PCR反應
PCR引物為上海Sangon公司合成。引物序列、反應條件及產物大小見表1。反應體系包括逆轉錄產物2 μl、10×PCR緩沖液2.5 μl、25 mmol/L MgCl2 1.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、25 μmol/L(c-myc與c-EBPε)或2.5 μmol/L(β-actin)上游及下游引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶1U，用滅菌去離子水補至終體積為25 μl。預實驗確定產物與循環之間呈線性關系范圍。取5 μl反應產物在15 g/L瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ml溴化乙錠）電泳，電場強度5 V/cm，紫外燈下觀察電泳結果，用凝膠成像系統（BIO-RAD公司）掃描分析條帶灰度，以目的基因與β-actin的灰度比做半定量分析。Table 1. Sequences of primers，condition of PCR and sizes of PCR products（略）
Western blot
收集藥物處理各組細胞（細胞數為2×106/ml），預冷的PBS漂洗2次，重懸于100 μl Lammiulis上樣緩沖液（0.125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，5%甘油）中，超聲波裂解，于4℃離心13 000×g）15分鐘，收集上清，蛋白樣品保存于-80℃。按蛋白定量試劑盒（Bio-Rad公司）操作說明書進行蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，轉移后的硝酸纖維素膜以5%脫脂奶粉封閉1小時，分別與抗人c-Myc和抗人β-actin抗體及辣根過氧化酶標記的二抗孵育。ECL顯色，顯影于膠片。圖像分析處理系統（Image Station 2000R）掃描，測定條帶的面積和灰度，以二者之乘積進行半定量比較分析。
統計學分析處理
各項實驗重復3次以上，以X±D表示，多組間比較F檢驗后采用方差分析及Tukey檢驗。相關分析采用Pearson相關。應用SPSS 10.0統計軟件進行統計分析。
結果
NB4細胞表面有CD13的表達
NB4細胞CD13陽性表達率為94.79%（平均熒光強度為1739.59），對照組HL-60細胞CD13陽性表達率為95.49%（平均熒光強度為3107.49）。兩者的CD13平均熒光強度有一定的差異，但陽性百分率差異不明顯。
Bestatin與ATRA聯合處理后NB4細胞形態改變明顯
100 μg/ml bestatin單獨作用72小時后，NB4細胞形態無明顯改變。10 nmol/L ATRA單獨作用72小時后，NB4細胞呈現部分分化的形態，細胞核/漿比例減小，核變小有凹陷。100 μg/ml bestatin與10 nmol/L ATRA聯合處理72小時后，NB4細胞形態分化更加明顯，細胞漿內空泡增多，核凹陷、扭曲更加明顯，形態似晚幼粒及桿狀核粒細胞的細胞增多（圖1）。
Bestatin與ATRA聯合應用后NB4細胞NBT還原能力明顯增加
以一定濃度（50、75和100 μg/ml）bestatin單獨處理72小時后，NB4細胞的NBT還原能力無明顯改變（與空白對照組相比較，P>0.05）；不同濃度（10、20和40 nmol/L）ATRA作用72小時后，NB4細胞的NBT還原能力呈濃度依賴性增加，與空白對照組相比，差異明顯。100 μg/ml bestatin與不同濃度ATRA聯合處理72小時后，NB4細胞的NBT陽性率明顯地提高，與單用相應濃度ATRA組相比，差異顯著（表2）。Table 2. Effect of bestatin on the NBT reduction activity of NB4 cells induced by ATRA. (略)
100 μg/ml bestatin單獨處理細胞不同時間（48小時-96小時），NB4細胞的NBT還原能力改變不明顯（與相應時間點空白對照組相比，P>0.05）；10 nmol/L ATRA處理細胞至72小時，開始出現NB4細胞NBT還原能力的增強，并呈時間依賴性，與相應時間點對照組相比，有明顯差異；而10 nmol/L ATRA與100 μg/ml bestatin聯合處理48小時，就出現NB4細胞NBT還原能力的明顯增強，且此作用隨時間延長而明顯增強，與相應時間點單用10 nmol/L ATRA組相比，差異顯著（圖2）。
Bestatin與ATRA聯合處理后NB4細胞CD11b表達明顯增強
100 μg/ml bestatin單獨處理72小時后，NB4細胞CD11b陽性表達率（MFI為13.4±0.6）稍有增加，但與對照組（MFI為12.3±0.9）相比，差異不顯著（P>0.05）。10 nmol/L ATRA單獨處理72小時之后，NB4細胞CD11b陽性表達率（MFI為19.2±4.2）明顯提高，與對照組相比，差異顯著（P
Bestatin和ATRA單獨及聯合處理后NB4細胞c-EBPε mRNA表達的變化
NB4細胞低表達c-EBPε mRNA。10 nmol/L ATRA處理12小時之后，NB4細胞c-EBPε mRNA表達水平明顯提高，與對照組相比較，差異顯著(P
Bestatin和ATRA單獨及聯合處理后NB4細胞c-myc表達的變化
NB4細胞c-myc mRNA呈高水平表達。10 nmol/L ATRA單獨處理4小時后，NB4細胞c-myc mRNA表達下降，與空白對照組相比較，差異明顯（P
Figure 4. Effect of bestatin and ATRA on the expression of c-myc mRNA of NB4 cells after treatment for 4 hours. M: marker; Lane 1: control. Lane 2: bestatin (100 μg/ml). Lane 3: ATRA (10 nmol/L). Lane 4: bestatin (100 μg/ml) +ATRA (10 nmol/L).
NB4細胞c-Myc蛋白呈高表達。10 nmol/L ATRA單獨處理8小時后，NB4細胞c-Myc蛋白表達水平明顯下降（P
討 論
ATRA對APL的有效治療是白血病誘導分化治療的成功典范。但單用ATRA治療易復發及產生耐藥，與其他化療藥物聯用時療效有一定的提高，但毒副反應增加。因此，尋找能夠增強ATRA誘導分化作用而毒副反應輕的藥物，成為臨床治療中的關注問題之一［7，8］。最近，Hirano等［7］根據NBT還原實驗結果提出，bestatin可能增強ATRA對NB4細胞的誘導分化作用，但未做進一步的研究。本研究通過對細胞形態、功能和表面分化抗原等多層次的檢測及分析對比，表明一定濃度范圍的bestatin本身不能誘導NB4細胞分化，但確能增強ATRA對NB4細胞的誘導分化作用。
Hirano等［7］認為，bestatin增強ATRA誘導分化作用可能與其抑制細胞表面CD13活性有關。本研究結果顯示，與HL-60細胞相似，NB4細胞表面CD13陽性表達率高達94.79%，該藥是否通過抑制CD13表達從而增強ATRA誘導NB4細胞分化的作用，尚待進一步研究證實。髓系祖細胞定向分化受轉錄因子活性的調節。ATRA調節與髓細胞定向分化有關轉錄因子的表達誘導APL細胞向中性粒細胞分化。氨基肽酶N/CD13為Ⅱ型跨膜蛋白，胞內端只有8-10個氨基酸，但最近研究報道，CD13分子能夠直接參與細胞內信號轉導的過程［9］。因此，本研究從藥物對轉錄因子影響的角度對氨肽酶、抑制劑bestatin增強ATRA誘導分化作用的可能機制進行了初步探索。c-EBPε為C-EBP家族轉錄因子之一，ATRA誘導NB4細胞向中性粒細胞方向分化時，藥物作用2小時，c-EBPε mRNA表達水平即開始增高，并持續增高至細胞終末分化［10］。而酪氨酸激酶抑制劑STI571增強ATRA誘導NB4細胞向中性粒細胞分化時，c-EBPε基因及蛋白的表達水平均未進一步增高［8］。本研究結果顯示，10 nmol/L ATRA處理12小時后，NB4細胞c-EBPε mRNA表達水平明顯上升，而100 μg/ml bestatin與ATRA聯合處理NB4細胞時，c-EBPε mRNA表達卻未進一步增強。這提示bestatin可能與STI571相似，其增強ATRA對NB4細胞的誘導分化作用可能不是通過調節c-EBPε表達。
原癌基因c-myc表達異常與髓細胞性白血病的發生有關，抑制c-myc表達可以促使白血病細胞分化及誘導細胞終末分化后的凋亡。本研究結果顯示，10 nmol/L ATRA單獨作用能夠使NB4細胞c-myc的表達下調，這與文獻報道相似［11］。同時，bestatin與ATRA聯合應用時c-myc表達水平的下調作用較單用ATRA時更加明顯，且藥物聯合應用各組細胞的c-myc蛋白表達水平與藥物誘導的NBT還原能力之間呈明顯的負相關。這提示bestatin可能通過與ATRA協同下調c-myc表達，從而增強ATRA誘導NB4細胞分化的作用。1，25-(OH)2 D3在誘導HL-60細胞分化時，激活蛋白激酶C，引起c-myc表達下調［12］。bestatin是否也通過激活蛋白激酶C增強ATRA下調c-myc的表達，這有待進一步研究證實。
【參考文獻】
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