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Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods
By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions
MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.
Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro
近年研究發現，成體骨骼肌中不但存在單能的成肌干細胞－衛星細胞，而且還含有多能的“肌源性干細胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干細胞起源于胚胎血管祖細胞，在適當的微環境中，可分化為血細胞、成骨細胞、神經細胞等不同胚層的組織細胞，MDSCs的表面標志已被初步認識，對其分化的研究，及其分離純化的技術研究正在進一步深入 ［1-3］。本實驗經過技術改良，通過體外原代培養獲得高純度MDSCs，為組織工程的臨床應用奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料 I型膠原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培養基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及鏈霉素(國產)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（異硫氰酸熒光黃）(武漢博士德)。
1.2 原代MDSCs的取材、分離純化 參照參考文獻所報道的方法［4，5］ ，選用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的醫用酒精中，5 min×3次，處死并消毒；無菌條件下取前肢肱三頭肌，后肢腓腸肌，盡可能剔除脂肪、肌腱等結締組織：用PBS液漂洗2次，將肌組織移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜狀；加入1%的Ⅰ型膠原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍體積的胎牛血清中止消化，反復吹打后濾過200目的篩網，收集濾液，1 000 r/ min離心7 min，室溫靜置5 min棄上層液，細胞團塊用生長培養基(含20%胎牛血清的DMEM)重懸，移入培養瓶中，該培養瓶稱為PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的細胞培養箱中靜置過夜，隨后將懸液轉移到另一個膠原包被的培養瓶中培養，此為PP2。此后連續4 d每隔24 h將懸液離心、重懸后轉移至新的培養瓶中，分別為PP3～PP6。PP1～PP5棄去不用，PP6用于進一步的鑒定實驗，細胞在達到約70%匯合時必須傳代。
1.3 MDSCs生長曲線的繪制 取PP6傳至第2代細胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104個／孔接種于24孔培養板。每日取3孔消化后，進行細胞記數，共7日根據記數結果繪制細胞生長曲線。
2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫熒光鑒定 取PP6中的MDSCs培養到第3代時，把細胞培養在6孔板中的蓋玻片上，第5 d細胞生長達70%～80%匯合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封閉液，常溫下靜置1 h，封閉非特異性結合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，照相。
2 結
果
2.1 分離細胞的形態、生長特性 PP1、PP2（圖1A）貼壁細胞相對較少，大部分是長梭形的成纖維樣細胞，其余是寬大而呈星形或不規則的雜細胞，增殖較快，1周左右即可完全融合。PP3（圖1B）開始即有少量的短梭形、圓形或多角形細胞貼壁，成纖維細胞較少。隨著純化的繼續，圓形或短梭形細胞的數量明顯增加，到PP6（圖1C）時超過80%，這些細胞貼壁后絕大多數為梭形或紡錘形， 有兩極， 體積小， 胞核折光性強。少數細胞呈多角形， 有突起。隨培養時間延長，細胞增殖、遷移逐漸形成規律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，若不加以控制及時傳代，細胞可迅速融合成細胞鏈或聚成團塊生長，細胞增殖速度減慢， 細胞相互融合， 形成肌小管（圖1D）。圖1A PP1、PP2貼壁細胞相對較少，大部分是長梭形的成纖維樣細胞和寬大而呈星形或不規則的雜細胞×200
圖1B PP3有少量的短梭形、圓形或多角形細胞貼壁，成纖維細胞較少×200
圖1C PP6圓形或短梭形細胞的數量明顯增加，超過80% ×200
圖1D 細胞增殖、遷移逐漸形成規律性的平行排列。極易融合，生長呈方向性，細胞增殖速度減慢，×200
圖1E、F 細胞特異性desmin染色呈陽性，熒光顯微鏡可見細胞發出綠色熒光×400
2.2 生長曲線 第2日開始進入對數生長期，第5日后由于接觸抑制，增殖速度減慢(圖2)。圖2 傳代MDSCs的生長曲線
2.3 對PP6的細胞表型鑒定 肌源性干細胞本身具有特征性的外形， 其胞漿中含有結蛋白(desmin) 可通過細胞免疫熒光方法鑒定。本實驗采用小鼠抗大鼠desmin一抗對肌源性干細胞進行鑒定，細胞質desmin染色陽性（圖1E，1F），細胞胞質呈現綠色熒光。觀察500個細胞，90%為desmin陽性。
3 討
論
近年在骨骼肌中發現了一群被稱為MDSCs的細胞群體。預期它們在組織工程應用領域特別是細胞移植和基因治療方面前景廣闊。國外已在進行大量MDSCs介導的相關的基因治療和組織工程的動物實驗［6-8］，并取得了較明顯的效果。因此建立和完善MDSCs培養方法，獲取高純度的細胞具有重要實用價值。
骨骼肌細胞是由胚胎的生肌節和各處的間充質細胞分化而成，在肌膜和基膜之間有一種體積較小的扁平成立方形細胞，稱為衛星細胞［9］，是保留在成年骨骼肌內具有增殖分化能力的單潛能成肌干細胞，這種組織特異性的干細胞在出生后骨骼肌的損傷、修復和維持中起重要作用。有證據表明新近發現的肌源性干細胞(MDSCs)是一群與衛星細胞完全不同的細胞群?？赡苁且蝗何聪蛉魏畏较蚨ㄐ偷脑几杉毎?。
lee等［7］31-37從骨骼肌細胞中發現了MDSCs，與衛星細胞相比，其具有更多的分化潛能，不僅能分化成骨骼肌纖維，促進肌組織再生，還能分化成成骨細胞，促進骨骼愈合［5］，被認為是衛星細胞的前體。貼壁前的MDSCs呈小而圓的球形，折光性強，剛貼壁仍為圓形，貼壁后的MDSCs呈紡錘形，延遲分瓶時會融合成成熟的多核肌管，這與成纖維細胞不同。preplate技術利用差速貼壁獲取MDSCs，其原理是成纖維細胞、內皮細胞的貼壁能力強于衛星細胞，衛星細胞的貼附能力又強于MDSCs，4 d內即可完全貼壁而此時MDSCs仍處于懸浮狀態［6］1085-1100，實驗中發現，組織塊中加入膠原酶后很快就變成了乳糜狀，胰酶對組織具有很好的離散作用，再通過反復吹打可將細胞從基膜中分離出來，得到的細胞為成纖維細胞、白細胞、內皮細胞、衛星細胞及MDSCs的混合物，利用差速貼壁法4 d后處于懸浮狀態的細胞移出培養即為純化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我們通過結蛋白desmin染色鑒定其肌源性，通過其多向分化的能力來鑒定其干細胞特性。實驗中我們還發現，隨著乳鼠出生天數的延長，所取得的MDSCs的數量和活力逐漸下降，但出生時間太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最適宜進行原代取材。
結蛋白（desmin）是中間絲蛋白的一種，是成肌分化的早期的標志，常作為肌源性的標志，雖然成纖維細胞與骨骼肌內血管平滑肌細胞也產生結蛋白，但此細胞中結蛋白含量低，與抗體產生弱陽性反應，且僅有15％的desmin陽性率［10］，而通過本方法獲取的MDSCs中desmin陽性率高達90%，由此可進行初步鑒別。
MDSCs屬于成體干細胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活時間長等優點，在組織工程和基因治療中具有廣泛的應用前景。通過對常規技術的改良，本研究建立了一種穩定高效的新生大鼠MDSCs分離純化技術，并成功對MDSCs進行了鑒定，為MDSCs在基因治療和組織工程的臨床應用打下了基礎。
參考文獻
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【中圖分類號】R691【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2009)10-0125-01
壓力性尿失禁(SUI)為女性的常見病和多發病，其發病率約為1 S%-6O%，多發生于老年人，因受經濟、宗教、教育程度等因素的影響，其實際發生率比統計發病率更高。SVl的癥狀嚴重與否都不自接危及生命，但它給患者的日常上作、生活及社交活動造成一定程度的影響，甚至會嚴重影響患者的生活質量乃至家庭和睦。
1臨床資料
注射療法是將藥物、化學制劑或自體組織等注入后尿道或膀肌頸內口粘膜下，使尿道腔變窄、拉長，延長功能性尿道的長度，提高尿道阻力，起到關閉尿道內口和后尿道的作用，從而達到有效控制排尿的口的。這一治療方法對尿道內括約肌功能障礙、尿道內壓降低同時尿道、膀肌無其他病變等壓力性尿失禁患者有較好的效果。注射療法主要優點在于.以在局部浸潤麻醉下進行操作，大多數患者的手術均.IJ.以在門診進行，適用于老年及不能耐一受大手術的患者。口前注射療法的研究主要集中在選擇不同的注射材料上，理想的注射材料應該在結構上完整，無毒、無免疫原性、無變應原性，近期內不會被分解，能長時間保持其支撐作用?？谇笆褂玫牟牧仙须y達到上述要求，因此尋找一種取材方便、生物相容性好、安全無毒、療效滿意的注射材料十分必要。
方法：無菌技術下獲取SD大鼠雙側腹股溝區脂肪墊，消化離心，長期培養的方法獲取脂肪源性間充質干細胞。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化，對培養細胞進行免疫細胞化學染色，鑒定其表面分子標志。SD大鼠24只分為3組，實驗組（6只），對照組一（3只），對照組二（3只）。分別獲取自體ADSCs，實驗組進行熒光標記。然后實驗組將熒光標記的ADSCs自體移植至尿道周圍，對照組移植未并取尿道組織進行HE染色組織學分析。
2結果
原代培養顯示培養的脂肪源性間充質干細胞2d左右開始壁,10d-14d左右可達90%融合,基本上為梭形成纖維樣細胞形態,免疫細胞化學示 CD29陽性，CD34陰性。神經切斷術后10天，除模型組和對照組一各有1只大鼠死亡外，均進行尿流動力學檢測，三組手術前后ALLP分別為：對照組一為27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，對照二為29.5±4.9和27.4±72.3,模型組為24.8±3.8和14.7±3.0。模型組手術后ALLP明顯降低，且組織學檢查亦證明模型組大鼠尿道周圍括約肌明顯萎縮。
3討論
本實驗將熒光金標記的脂肪源性干細胞自體移植至大鼠的近端尿道周圍，行冰凍切片，組織化學染色，熒光顯微鏡下觀察.見熒光標記的細胞呈金黃色:后取組抗體免疫移植部位有較多的Desmin陽性的細胞，棕黃色，部分出現一定的方向性，未見明顯炎癥細胞浸潤，說明己有細胞在局部存活并生長，提示能成為壓力性尿失禁注射治療的一種理想的注射材料，為將來進行細胞移植治療壓力性尿失禁提供了實驗依據。
結論：①大鼠脂肪組織中含有豐富的多能干細胞。利用消化離心，長期培養的方法可獲取大量的干細胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周圍成活并生長分化。
參考文獻
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1. 1 材料
1. 1. 1 主要儀器:CO2培養箱、凈化工作臺、倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、流式細胞儀。
1. 1. 2 主要試劑:DMEM 高糖培養基( Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM)、人表皮生長因子(EGF)、0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 緩沖液購自于 Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 購自與 Abcam 公司。CD29、CD44 購自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 購自于 BD 公司。
1. 1. 3 實驗動物:SPF 級孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，購自中國軍科院實驗動物中心，許可證號:[SCXK-(軍)2014-0004]，實驗動物使用批準號:ILAS-PL-2014-001。在無菌條件下進行實驗操作分離羊膜組織。
1. 2 方法
1. 2. 1 羊膜細胞分離及培養:SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉(0. 01 mL /g)，麻醉后，無菌條件下開腹，機械性分離子宮層，剝離胎盤，分離羊膜組織置于含有500 U/mL 雙抗的 PBS 溶液中沖洗。將羊膜組織放置在含有500 U/mL 雙抗的 DMEM 基礎培養基中，無菌眼科剪將其剪至1 mm3左右的小塊。將組織懸液移至50 mL 離心管中，1 000 r/min 離心 5min，棄上清液。加入 0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶10 mL，37℃ ，5% CO2條件下消化 20 ～30 min。用含有10%胎牛血清的完全培養基終止消化。200 目不銹鋼濾網過濾單細胞懸液，接種至 25 cm2培養瓶，含10% FBS、10 g/LEGF 和 500 U/mL 雙抗的DMEM 完全培養基培養，隔天細胞換液，2 ～ 3 d 后細胞長滿培養瓶85% ～90%時，進行細胞傳代。
1. 2. 2 流式細胞術檢測:取培養 2 ～ 4 代細胞，用0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的DMEM 完全培養基終止消化。細胞計數將其稀釋成1 106個，每個流式管1 mL 細胞懸液。每流式管加2 mL PBS 使細胞混勻，2 000 r/min 離心5 min，棄上清液。重復加2 mL PBS 重懸細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。每管加 50 L PBS 重懸細胞，加 抗 體 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室溫孵育 30 min。每管加2 mL PBS 重懸細胞2000 r/min 離心5 min，棄上清液。各管加300 L PBS 重懸細胞上機檢測。
1. 2. 3 免疫熒光細胞染色:取 2 ～ 4 代細胞，0. 25%含 EDTA 胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的 DMEM 完全培養基終止消化。加入完全培養基重懸，至24 孔板中培養。待細胞增殖至 70% 作用時，PBS 沖洗，4% 多聚甲醛(預冷)固定 10 min。PBS 沖洗 2 次，每次5 mim。1% Tuiton-100 孵育10 min。PBS 沖洗2 次，每次 5 mim。山羊血清工作液每孔 100 L 室溫下封閉30 min。吸去山羊血清工作液，抗體稀釋液稀釋抗體 Oct-4(1∶ 200)、Sox-2(1∶ 200)、SSEA-4(1∶200)、nestin(1∶100)、vimentin(1∶100)，每孔100L，4℃過夜孵育。PBS 沖洗 3 次，每次 5 min。避光條件下，PBS 稀釋 FITC 標記的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃避光孵育 30 min。PBS 沖洗 3 次，每次5 min。DAPI 封片劑封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察。
1. 3 統計學方法實驗結果采用 x珋 s 表示，使用 SPSS 15.0 統計軟件進行統計處理，對其進行單因素方差分析和LSD 檢驗，P 0. 05 表示差異具有統計學意義。
2 結果
2. 1 分離細胞培養分離培養大鼠羊膜細胞，鏡下，細胞呈變形蟲樣生長(圖 1a)，生長速度快(圖 1b)，需隔天換液傳代。本實驗中大鼠羊膜細胞可傳至6 ～7 代。
2. 2 流式細胞術鑒定細胞表面抗原結果經流式細胞術鑒定大鼠羊膜細胞間充質細胞表面標記物 CD29、CD44 分別為97. 6%和95. 8%。細胞表面抗原CD90、CD45 幾乎不表達，CD11b 有少量表達(圖2 見文后彩插6)。
2. 3 細胞免疫熒光鑒定細胞表面標記物結果本實驗通過細胞免疫熒光方法檢測大鼠羊膜細胞表達干細胞標記物 Oct-4 和 Sox-2(如圖 3)，神經干細胞標記物 nestin 和間充質干細胞標記物vimentin(如圖 4)，( 圖 3 ～ 4 見文后彩插 7) 并表達胚胎干細胞標記物 SSEA-4(如圖 5)?？杀磉_神經營養因子 BDNF 和NGF(如圖6)(圖5 ～6 見文后彩插8)。
3 討論
Analysis of different protein expressions in different liver cell strains in vitro using SELDI
【Abstract】 AIM: To examine the differential expressions of proteins in hepatoma cell line (HepG2)，hepatoma cell line transfected by HBV （HepG2.2.15）compared with normal liver cell line(LO2) by using surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (SELDITOFMS)， so as to establish a foundation for further studying on the mechanism of hepatoma at the protein level. METHODS: The 3 types of cells above mentioned were cultured as general and collected when they were in good conditions. After cell disruption， SELDITOFMS was employed to detect the differential expressions of proteomes of HepG2， HepG 2.2.15 and LO2. RESULTS: Ninetyone proteins were captured by WCX2 array. Compared with normal liver cell lines， in the segments from Mr 5000 to 15 000， proteins in the HepG2 and HepG2.2.15 showed apparent changes， in which 2 proteins expressions were increased in carcinoma cells， the other 5 decreased. Nine proteins in HepG2 were increased and 10 proteins in HepG 2.2.15 were increased. CONCLUSION: The SELDI ProteinChip technology can be a desired method in detecting the biological markers in the earlier period of hepatoma. This method is of convenience， high sensitivity， and good reproducibility. The biological tags of tissuespecific proteins we found have a potential applying value in the early diagnosis of hepatoma. These tags are also meaningful in screening and identifying signal proteins from serum and tissue specimen in different types of hepatoma. Certain foundation has been established in studying the etiopathogenesis of hepatoma at the level of proteins， as well as the searching of new therapeutic target sites.
【Keywords】 SELDITOFMS; protein array analysis; liver neoplasms; tumor cells， cultured; distinct protein
【摘要】 目的： 運用表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質譜(SELDITOFMS) 技術，檢測體外培養的肝癌細胞株（HepG2），轉染乙肝病毒的肝癌細胞株（HepG2.2.15）與正常肝細胞株（LO2）蛋白質的差異表達，篩選肝細胞癌的標志蛋白，為進一步研究肝癌發病的蛋白質組學機制奠定基礎. 方法： 常規培養上述3種細胞，細胞狀態良好時收集細胞，裂解細胞后采用 SELDITOFMS技術用WCX2芯片檢測HepG2， HepG2.2.15， LO2細胞內蛋白質組學的差異表達. 結果： WCX2芯片共捕獲91個蛋白，在Mr 5000~15 000區段，與正常肝細胞株比較，有7個蛋白質在兩種肝癌細胞中出現明顯變化，其中2個蛋白在肝癌細胞中表達量增高，5個蛋白在肝癌細胞中表達量降低；另外兩種肝癌細胞株也有其各自的標志蛋白，9個蛋白分子在HepG2表達量增高，10個蛋白分子在HepG2.2.15表達量增高. 結論： SELDI蛋白芯片技術檢測可作為檢測肝癌早期生物標記的方法，它簡便，敏感性高，重復性好，本文發現的這些組織特異性蛋白生物標記對肝癌的早期診斷有潛在的應用價值，對我們從血清或組織標本中篩選和鑒定不同型別肝癌細胞之間的標志蛋白有重要意義，從而為從蛋白質水平研究肝癌的發病機制及新的治療靶位的尋找奠定了一定的基礎.
【關鍵詞】 表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質譜；蛋白質陳列分析；肝腫瘤；腫瘤細胞，培養的；差異蛋白
0引言
原發性肝癌(HCC)在我國是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在部分城市中占惡性腫瘤死因的第二位. 每年有11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數的45%. 肝癌早期沒有明顯體征，多數病人確診時已屬晚期，難以治愈，死亡率很高. 所以，對于肝癌的早期診斷，在無癥狀的人群中發現早期病例，對控制肝癌的病死率有現實的意義. 因此，研究并尋找有價值的預警肝癌的標志物，成為進一步提高肝癌臨床治療水平的關鍵. 任何疾病在出現病理變化之前，細胞內的蛋白質在成分和數量上都會有相應的改變，癌癥的發生是一個多基因多階段多因子的動力學過程，HCC也不例外，目前對肝癌發生機制的研究大都是在基因水平，但是mRNA的水平并不能真正代表所表達的蛋白質水平，因此，要求對生物功能的執行者蛋白質進行研究.
蛋白質組是指一個基因組、一個細胞或組織或一種生物體所表達的全部蛋白質［1］. 蛋白質組學（Proteomics）是蛋白質組概念的延伸，是在整體水平上研究細胞內蛋白質組成及其活動規律的學科. 蛋白質組學技術為研究腫瘤標志物與腫瘤進展轉移研究提供良好的技術平臺， 為研究開辟了新的手段和視角. SELDI蛋白質芯片技術是近年來新興的一種蛋白質組學技術，它具有簡單、快捷、靈敏等特點，可以檢測分子量在Mr 500~500 000之間的蛋白或多肽，而且所需樣本體積?。?.5~400 μL）［2-3］. 我們應用細胞裂解液裂解體外培養的3種細胞（LO2， HepG2， HepG2.2.15），進行了表面增強激光解吸/離子化/飛行時間質譜技術（SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝細胞、肝癌細胞與轉染乙肝病毒的肝癌細胞的蛋白表達圖譜［4］，發現了一系列（信噪比）差異表達的蛋白，為今后從血清或肝癌組織中篩選標志蛋白提供科學依據.
1材料與方法
1.1材料正常肝細胞株（LO2）購自中科院上海細胞庫；肝癌細胞株（HepG2）及攜帶乙肝病毒的肝癌細胞株（HepG2.2.15）由第四軍醫大學吳力克主任醫師贈送. HPLC水，乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA），TritonX100，尿素，4羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），表面活性劑（CHAPS）均購自美國Sigma公司，蛋白質芯片時間質譜分析儀（PBSⅡC）及WCX2（弱陽離子交換芯片）購自美國Ciphergen Biosystems公司.
1.2方法
1.2.1細胞總蛋白質的提取LO2， HepG2細胞采用含100 mL/L胎牛血清的1640培養基培養，HepG2.2.15細胞另外加入終濃度200 g/L的G418，細胞長成單層后，用無菌細胞刮刀刮取細胞，PBS洗3次，加入裂解液（8 mol/L urea， 40 g/L CHAPS， 40 mmol/L TrisHCl， pH 7.4）200 μL， 4℃劇烈震蕩30 min， 20 817 g離心30 min. 上清采用日本日立的 Gene Spec V蛋白核酸分析系統測定蛋白濃度，用裂解液調節至所有樣品濃度為2 g/L，其余上清分裝-86℃備用. 每種細胞收獲3次，以排除組間差別. 每份樣品至少在2個以上的同種芯片上檢測，以排除不同芯片間的差異.
1.2.2WCX2蛋白芯片操作步驟將芯片裝入蛋白工作平臺，每孔加入200 μL結合/洗脫緩沖液（50 mmol/L NaAc， pH 4.0）預處理芯片，室溫下200 r/min振蕩5 min，棄緩沖液，重復上述操作1次. 每孔加入50 μL 1∶2稀釋的樣品，劇烈震蕩，室溫孵育1 h. 棄掉樣品，每孔用200 μL結合/洗滌緩沖液洗滌2次，每次震蕩5 min. 棄去孔中液體，每孔加入200 μL HPLC 水，立刻甩出. 從蛋白工作平臺中取出芯片，空氣中干燥，每孔加入0.5 μL EAM（SPA中加入75 μL乙氰和75 μL 10 mL/L三氟乙酸）重復1次. 干燥后用蛋白質芯片閱讀機進行質譜分析.
1.2.3數據采集和結果分析用加有Allinone標準分子量蛋白的NP20芯片校正質譜儀，儀器參數設置如下： 激光強度220，檢測敏感度10，優化分子質量范圍為Mr 2000~10 000，最高分子量為Mr 50 000，采用Ciphergen ProteinChip 3.0版本的分析軟件自動采集數據，然后用Biomarker Wizard 軟件分析LO2， HepG2， HepG2.2.15細胞的蛋白質譜差異.
2結果
2.1重復性試驗為了保證試驗結果的可靠性，我們首先進行細胞計數為1010/L，樣品蛋白濃度為2 g/L以減少細胞本身蛋白的差異；同時每種細胞收獲3次，以排除組間差別；每份樣品至少在同種芯片3個以上不同點進行檢測，以排除不同芯片點之間的差異. 然后用SELDITOFMS對樣品孔進行測定，經質譜分析后選擇了8個蛋白峰，測變異系數，結果顯示其M/Z及強度的CV分別為1%， 5%，分析結果表明試驗重復性好，結果可靠.
2.2差異蛋白的比較
2.2.1LO2， HepG2， HepG2.2.15三者比較明顯差異蛋白峰共7個，其中Mr 7945， 7979在肝癌細胞中表達增高， 5818， 8428， 10 106， 10 312， 11 084在肝癌細胞中表達降低（圖1）.
2.2.2肝癌細胞和轉染乙肝病毒的肝癌細胞蛋白質表達差異HepG2， HepG2.2.15細胞差異蛋白峰共19個， 9個蛋白峰在肝癌細胞中表達增高，10個蛋白峰在肝癌細胞中表達降低（圖2）.
2.2.3差異蛋白質的初步鑒定將發現的差異蛋白峰在Swiss蛋白數據庫中搜索（us.expasy.org/tools/tagident.html），發現Mr 11 084.0蛋白峰與鈣結合蛋白S100 A10相符. 其他幾種蛋白暫時尋找不到.
A： LO2細胞；B： HepG2.2.15細胞；C： HepG2細胞. 上部分為蛋白峰表達情況: 橫坐標表示相對分子量，縱坐標表示蛋白質峰的強度；Mr 11 084.6， 10 106.4蛋白在LO2中表達最高，在HepG2中次之，在HepG2.2.15中最低. 下部分為蛋白質圖譜的模擬凝膠圖： Mr 11 084.6， 10 106.4兩條帶是LO2， HepG2.2.15和HepG2細胞的差異蛋白.
圖13種細胞在Mr 10 000~11 500區段的蛋白質檢測結果（略）
A: Chip 19C G2; B: Chip 19H 2.2.15. 橫坐標表示相對分子量，縱坐標表示蛋白質峰的強度. Mr 10 106.4， 11 084.0， 11 658.4蛋白在HepG2中高表達，在HepG2.2.15中低表達.
圖2HepG2， HepG2.2.15細胞在Mr 10 000~12 000區段的蛋白質檢測結果（略）
3討論
腫瘤早期就可在蛋白質水平出現細微但重要的組合改變［5］，近來研究表明，腫瘤性疾病從蛋白質組學的角度又可以被認為是一種蛋白質缺陷病，其發生過程中有多種蛋白會發生異常變化. 從組織增生產生原位癌到產生癌變的過程中，有不同的功能性蛋白的參與；轉移也是多步驟復雜連續的過程， 與轉移有關的特殊基因受到激活并有多種水解酶的參與. 總之， 腫瘤在發生發展轉移的過程中， 在分子水平有不同的功能性蛋白參與， 并且功能性蛋白很可能在各個環節相互協調共同表達. 蛋白表達異常不僅包括蛋白表達量的增加或減少，還包括蛋白翻譯后加工上的改變，從而導致腫瘤組織表達的蛋白質譜(protein profile) 的改變. 因此利用蛋白質組學方法檢測蛋白質譜的變化可以更加準確地診斷腫瘤及了解腫瘤的發病機制.
臨床上現有的HCC標志物眾多，但尚無單一標志物能夠診斷所有HCC. 這就需要探索一種新的技術以發現早期腫瘤標志物. SELDI蛋白質芯片技術可檢測疾病進展中不同階段血清中多肽量的變化，翻譯后修飾的改變或某些多肽的聚糖結構變化，為HCC腫瘤標志物的進展提供了一個新的方法，它靈敏度高、特異性好、重復性強、操作簡單且微量化［6］，可同時檢測血清中的多種蛋白質已被應用于檢測多種生物學樣品.
體外培養的細胞株雖然不能完全反映體內細胞的生長狀態和生物學活性，但它具有成分單一、均質性好、實驗條件容易控制等優點. 尤其在做對比性研究時可避免由組織細胞成分復雜，細胞異質性高等缺點造成的結果不真實和不可靠［7］. 我們培養了LO2， HepG2和HepG2.2.15細胞，裂解細胞蛋白定量后SELDITOFMS分析蛋白表達的差異. WCX2芯片，用于分析正電荷蛋白，弱陽離子碳化合物構成活性位點，與樣品中賴、精或組氨酸反應，它捕獲的蛋白pI一般大于4. 我們在分子量Mr 3000~30 000范圍內，共捕獲91個蛋白峰. 其中肝癌細胞株與正常肝細胞株差異蛋白共7個，不同亞型肝癌細胞與正常肝細胞比較有共同的差異蛋白，說明在肝癌的發生或發展過程中涉及到一些共同的蛋白質改變；我們對不同類型的肝癌細胞株差異蛋白質進行分析，結果HepG2， HepG2.2.15細胞差異蛋白峰共19個，表明不同肝癌細胞株也具有特異的差異蛋白，這對我們從血清或組織標本中篩選和鑒定不同型別肝癌細胞之間的標志蛋白有重要意義.
這些組織特異性蛋白生物標記對我們從血清或組織標本中篩選或鑒定標志蛋白有重要意義，對肝癌的早期診斷有潛在的應用價值，更主要的是為研究肝細胞癌變機制提供了一個基礎，而且這些蛋白有可能為肝癌治療提供新的靶位，可以進行RNA干擾來阻斷其高表達或通過基因導入來促進低表達蛋白的表達.
用Swiss蛋白數據庫中檢索分子量和pI值匹配的蛋白質發現Mr 11 084蛋白峰可能為鈣結合蛋白S100 A10. S100蛋白家族是一個有21個成員的鈣結合蛋白家族， S100蛋白通過對鈣離子的調節及與靶蛋白的相互作用，在體內發揮多種生物學功能. 研究發現 S100家族與腫瘤的發生發展關系密切，它們參與細胞周期調控，在多種腫瘤中表達異常，并與腫瘤的浸潤、轉移有關. S100 A10在腫瘤發生中的作用還不確定，它可能與Annexin II（p36）組成復合物，抑制p36磷酸化，參與細胞周期調控［8］. 在肝癌的發生中S100 A10可能通過p36起作用，它在肝癌細胞 HEPG2中低表達，抑制p36磷酸化的作用降低，從而抑制細胞增殖的作用降低，可能引起細胞生長失控而致癌.
從理論上講，肝癌在發生、發展過程中其細胞內的蛋白質變化可以反應到血清中，可從體外培養的肝癌細胞株中篩選出部分與癌病人血清相一致的標志蛋白，有些改變可能只存在于細胞內而不分泌或代謝到細胞外，這部分蛋白可能是與癌癥的發病密切相關的功能蛋白和調節蛋白.
目前，我們正進一步研究HBV感染攜帶者與HCC患者及正常人血清蛋白質的差異表達，結合體外培養細胞株的研究通過對比分析進一步篩選差異蛋白，下一步我們將蛋白純化后進行序列測定，應用串聯質譜分析鑒定特定的蛋白，以期確認肝癌的標志蛋白和功能蛋白，為臨床肝癌的診斷提供新的思路，以期使肝癌的血清學診斷成為可能.
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信息技術是伴隨計算機和網絡技術的發展而發展的，如今信息技術已經進入了發展的全盛時期，信息技術的發展對人們的生活、學習及工作方式產生了廣泛而深刻的影響。在此背景之下，政工干部的培養工作也不免受到信息技術發展的影響，如何準確地把握信息技術發展水平及趨勢對于政工干部培養產生的影響，科學利用信息技術的強大功能來提高政工干部培養的質量，是所有企事業單位需要思考的問題，婦幼保健院也不例外。
一、信息技術發展對婦幼保健院政工干部培養的影響
1.信息技術發展對政工干部素質提出了更高的要求
信息技術的發展使得信息化素質成為政工干部的基本素質之一，婦幼保健院的政工干部也不例外。信息化素質是指主體所擁有的各種信息品質，包括信息智慧、信息道德、信息意識、信息覺悟、信息潛能和信息心理等內容。信息化素質能讓政工干部跟上時展的潮流，掌握最新的信息技術，也能讓政工干部認識到信息的重要性而自覺地利用信息提高工作質量，培養政工干部終身學習意識。婦幼保健院作為醫療體系的一部分，一些醫療技術和醫療設備更新速度很快，政工干部必須具備較高的信息化素質才能捕捉到這些信息。具體來說，信息技術的發展要求婦幼保健院的政工干部全面提高自身素質，學好信息知識、掌握信息技能的同時，還要學習政工理論知識、醫療專業知識及人文社科知識等，培養政工干部的領導管理能力、溝通交流能力等。
2.信息技術發展對政工干部素質培養提供了新的條件
信息技術的發展改變了傳統的信息的載體形式，拓寬了信息傳播的渠道，極大地縮短了信息傳播所需要的時間，使個人獲得信息的成本大大降低，為政工干部的培養創造了有利的條件。首先，政工干部學習、溝通渠道更廣。婦幼保健院可以在政工干部的培養課程中使用各種計算機輔助教學方式，它使課程內容更加生動有趣，能更好地激發政工干部的學習興趣；依靠網絡教學的方式還可以讓政工干部充分利用網上豐富的信息資源，相互交流學習；此外政工干部還可以合理安排自己的學習時間，選擇自己的學習方式，培養方式更加個性化。其次，政工干部利用信息的方式發生了改變。過去婦幼保健院的政工干部獲取信息主要靠閱讀各種紙質材料，現在政工干部閱讀的載體擴展到網絡信息，從文字擴展到圖像、聲音、三維等；在表達方式上實現了從直接手寫到鍵盤輸入、掃描等，包括直接復制或者刪減其他文件；在計算方式上也不再需要人工計算，利用計算機準確又迅速減輕了政工干部數據統計分析的負擔。
3.信息技術發展對政工干部素質培養帶來的問題
首先，信息鴻溝現象比較嚴重。在婦幼保健院的政工部門中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用現代信息技術方面也存在較大差異，這給政工干部的信息培養課程增加了不小的難度。其次，網絡信息量過于龐大。信息技術的發展使得，各種信息都能在網絡上迅速傳播，過量的信息會使人們很難找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是嚴重影響政工干部的培養工作。
二、提高婦幼保健院政工干部培養質量的對策
1.定期完善政工干部培養方案
信息技術的發展變化是日新月異的，婦幼保健院要保證政工干部的培養緊跟時代的步伐就必須根據時代的變化對培養方案和教學計劃進行全面的調整和修訂，但是不能改變的是要始終強調培養信息化素質的重要性。培養方案的完善和修改可以從以下幾方面入手：教學目標、教學內容、教學課程專題、教師師資、教學材料和教學組織形式等，要突出強調信息化素質的地位。
2.精心設計培養的專題體系
婦幼保健院政工干部培養的基本平臺就是課程專題，怎樣設計合理的課程專題也成為政工干部培養工作的難題，可以明確的是必須要依據信息技術的發展對各類政工干部知識能力素質的客觀要求來建立課程專題體系，同時也要根據不同教學對象的性質、層次和類型做出調整。要根據政工干部的培養目標確定專題的類別和課時比例，各類專題都有圍繞解決新時期思想政治教育工作來設計，專題設置和內容都要做到內容精干、素材新穎、實在管用，不僅要包括信息化知識和技術的課程，還要有其他方面的課題。
3.打造政工干部培養的環境條件保障體系
婦幼保健院可以從以下幾個方面來支持政工部門的信息化工作。首先，配置完備的教學設施設備，包括計算機及網絡、多功能教室等。其次，建設多樣的信息化教學信息資源子系統，例如數字化圖書館信息資源、課程網絡信息資源、教學管理信息資源等。
總之，為了讓信息技術的發展更好地為婦幼保健院的政工干部培養工作服務，需要站在全局的高度將信息技術理論和方法應用到培養的全過程中，需要對政工干部培養的形式、內容、方法進行深刻變革，以提高政工干部培養的效率，全面提高政工干部信息化素質培養的質量和效益。
參考文獻：
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目的 ：研究糖尿病是否會導致在體外培養條件下自體骨髓間充質干細胞的增殖、分泌和抗凋亡能力的改變。方法：利用鏈脲佐菌素（STZ）誘導制作成年大鼠糖尿病模型（n=6），正常大鼠作為對照組（n=6），分別于體外利用全骨髓貼壁法來擴增和純化骨髓間充質干細胞后，取生長良好的第2代細胞作為本實驗的研究對象。采用Cell Count kit-8（CCK-8）分別繪制兩組細胞的生長曲線來評價增殖能力；采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血管內皮生長因子（VEGF）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的分泌量；應用Hoechst33342染色和膜聯蛋白V/PI雙染流式細胞術觀察細胞在低氧無血清條件下的抗凋亡能力。結果：來源于糖尿病大鼠的骨髓間充質干細胞的增殖較正常的大鼠顯著性減慢（P
【關鍵詞】 糖尿病 間充質干細胞 VEGF 細胞凋亡 增殖 大鼠
Abstract: Objective: To study the effect of diabetic inner environment on the biological properties of marrow mesenchymal stem cells derived from bone(BMSCs). Methods: BMSCs were harvested from the normal and diabetic rats induced by streptozotocin (STZ). Cell proliferation was evaluated using cell counting kit-8 (CCK-8) assay. The secretory volume of vascular endothelial growth factor (VEGF) and insulin-like growth factor (IGF-1) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the anti-apoptosis capacity of the cell under the hypoxia and serum deprivation (hypoxia/SD) was detected by Hoechst33342 staining and annexin V/PI dual-color flow cytometry. Results: BMSCs from the diabetic rats induced by STZ could be successfully harvested and expanded in vitro. However they showed more spread-out and flattened appearance and larger size. The proliferative ability of diabetic rats derived from BMSCs were significantly decreased compared with the normal rats (P
Key words: diabetes；mesenchymal stem cells；vascular endothelial growth factor；apoptosis；proliferation；rats
干細胞治療心肌梗死已被證實是一種較有前景的治療方法。骨髓間充質干細胞（bone mar-row mesenchymal stem cells，BMSCs）由于具有取材容易、體外增殖能力強、低免疫原性、可分化為不同類型的成熟細胞等優點[1-2]，成為最佳的移植細胞來源。但是和其他體細胞類似，BMSCs也易受各種因素如：年齡、氧化應激和高糖[3-4]等的影響而導致其生物學性狀改變。
糖尿病患者復雜的體內環境，包括長期的高血糖、高血脂、酮體的增多、活性氧等，勢必會對自身體內的BMSCs產生影響[5-6]。目前國內外在干細胞治療心梗的研究中，大多采用正?；蛘吣贻p的BMSCs作為移植細胞來源。為了確定糖尿病體內環境對BMSCs的影響以及其能否作為自體移植的細胞來源，我們將以糖尿病大鼠來源的BMSCs作為研究對象，在體外培養條件下進行一系列的生物學特性檢測，就此問題進行初步探討。
1 材料和方法
1.1 動物
220 g Spraque Dawley(SD)大鼠由溫州醫學院實驗動物中心提供，所有研究都經溫州醫學院實驗動物委員會批準。
1.2 主要試劑
DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；鏈脲佐菌素（STZ）、Hoechst 33342購自Sigma公司；細胞低氧培養盒、缺氧催化劑購自BioM6rieux-sa(France)；膜聯蛋白 (annexin)-V FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物公司；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自R&D公司。
1.3 糖尿病大鼠模型的制備
12只健康的SD大鼠隨機平均分為兩組，分別為糖尿病組和正常對照組。兩組大鼠在禁食12 h后分別予單次腹腔注射STZ檸檬酸緩沖液(55 mg/kg)和檸檬酸緩沖液。3 d后剪尾靜脈測血糖，以>16.67 mmol/L視為糖尿病模型成功，腹腔注射后3周復測1次尾靜脈血糖和體重，以確保血糖濃度>16.67 mmol/L。糖尿病模型合格的和正常對照組大鼠繼續飼養10周，為下面實驗做準備。
1.4 骨髓間充質干細胞的分離和培養
無菌條件下分別剝離糖尿病大鼠和正常對照大鼠的股骨和脛骨[3]，以全骨髓貼壁法分離并培養BMSCs，待狀態良好的第二代細胞生長達到70%～80%匯合時可用于以下實驗。
1.5 細胞增殖能力檢測
取生長良好的第二代骨髓間充質干細胞，于96孔板的每個孔中加入100μL細胞懸液，細胞數為1.5×103，培養基每2天更換一次。于細胞接種后的7 d內，每天取5個孔進行檢測，每個孔內加入CCK-8試劑10μL，置培養箱內孵育4 h后，用全自動酶標儀檢測490 nm（參比波長630 nm）的吸光度值（OD值），取平均值，以培養時間為橫坐標，以相應的OD值為縱坐標，描繪生長曲線。
1.6 間充質干細胞凋亡的檢測
1.6.1 細胞模擬缺血處理(無血清和低氧聯合處理)：當第二代細胞生長達到70%～80%匯合時用PBS沖洗2次，加入不含胎牛血清的DMEM培養基，然后迅速將細胞放入密閉低氧罐中，置于37 ℃、5% CO2 細胞培養箱內培養6 h。
1.6.2 形態學檢測：將進行低氧和無血清處理后的細胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的無血清DMEM培養基，Hoechst33342終濃度為0.1 mg/mL，室溫避光反應10 min。用熒光顯微鏡觀察，紫外光激發，觀察凋亡細胞并攝片。
1.6.3 流式檢測：取經低氧無血清處理的7×105個細胞，用0.125%胰蛋白酶/0.04% EDTA消化細胞后，4 ℃，以800 r/min離心4 min后，棄掉上清液；細胞用PBS沖洗1次后懸浮于200μL結合緩沖液。然后加入10μL 20μg/mL的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的膜聯蛋白V(膜聯蛋白-V-FITC)，輕輕混勻后，4 ℃避光反應15 min。加入5μL 50μg/mL的PI，300μL結合緩沖液，輕輕混勻，用流式細胞儀檢測活細胞、早期和中晚期凋亡細胞及壞死細胞所占的比例。
1.7 血管內皮生長因子（VEGF）和胰島素生長因子-1（IGF-1）的ELISA檢測
將生長良好的第二代骨髓間充質干細胞用PBS沖洗1次后，添加不含血清DMEM培養基置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內培養6 h后，取上清液備用。按照ELISA試劑盒操作說明書，用雙抗體夾心法分別檢測細胞培養上清中VEGF和IGF-1的含量，每份標本設3個復孔。用全自動酶標儀測450 nm處吸光度值，取其平均值，根據所繪制的標準曲線計算出各個細胞因子的含量。
1.8 統計學處理方法
采用獨立樣本t檢驗。
2 結果
2.1 大鼠BMSCs的培養和增殖能力檢測
采用常規細胞原代培養法，成功培養了糖尿病大鼠的BMSCs。相差顯微鏡下對細胞形態進行了觀察，如圖1A所示培養的原代細胞呈長梭型，集落生長，中間較密，夾雜著圓形高亮未貼壁的雜細胞，但是糖尿病大鼠的BMSCs所形成的集落較正常大鼠的明顯要小，而且貼壁后4~5 d才表現出成纖維樣生長特性。細胞傳代后，在第1代和第2代細胞生長呈現明顯的漩渦狀，但是相對于正常大鼠BMSCs飽滿的細胞形態，糖尿病大鼠的則表現為細胞伸展無力，且較為扁平。本實驗所用細胞均為第2代BMSCs。利用CCK-8檢測的結果顯示(見圖1B)，糖尿病來源的骨髓間充質干細胞增殖能力明顯較正常來源的低（P
2.2 VEGF和IGF-1的分泌量
ELISA結果（見圖2）顯示糖尿病大鼠來源BMSCs的VEGF和IGF-1的分泌量較正常來源的明顯降低(分別為P
2.3 細胞凋亡
在缺血無血清聯合處理后(圖3A)，相差顯微鏡照片可以顯示明顯的細胞凋亡表征，即胞核皺縮變圓，貼壁細胞數量明顯地減少。Hoechst33342染色后，正常細胞核呈彌散均勻的熒光， 而凋亡的細胞， 細胞核與細胞質中可見濃染致密的顆粒熒光， 被認為是典型的凋亡細胞。
2.4 膜聯蛋白V/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡膜聯蛋白
糖尿病來源的BMSCs中早期凋亡細胞(膜聯蛋白為V+/PI-）較正常大鼠來源的明顯增多（P 0.05）。
3 討論
隨著冠心病發病機制研究的深入，更多的證據表明，作為代謝綜合征之一的糖尿病和冠心病的發生有著密切的關系[5]。而糖尿病患者體內的高糖、酮體、氧化產物等有害物質的增多，勢必對自體來源的BMSCs的性狀產生影響。在本研究中我們通過利用STZ誘導糖尿病大鼠模型，在經體外培養后發現，糖尿病來源的BMSCs在增殖能力上明顯減弱，并且在細胞的分泌和抗凋亡能力上也較正常大鼠來源的顯著降低。
在BMSCs治療心肌梗死的研究中，首先要在體外擴增得到移植所需的細胞量。我們在研究中發現，在原代培養中糖尿病來源細胞在貼壁后4～5 d才表現出成纖維樣生長的特性，且糖尿病來源的BMSCs的增殖能力明顯降低，并且細胞較為扁平。原代體外貼壁時間的延長和細胞形態的變化說明其對環境的適應能力降低，需要較長的時間來恢復其生長增殖能力。另外有研究表明，傳代后細胞變為扁平，具有這樣的形態特征為細胞衰老的表象[7]，并且與我們所得出的增殖能力的下降是相一致的。
另外在BMSCs移植提高梗死后的心功能上，干細胞所分泌的細胞因子被認為是提高心功能的主要因素之一[8]，其中VEGF和IGF-1在促進新生血管的生成和細胞增殖方面起著非常重要的作用。我們的研究表明，糖尿病來源的BMSCs其VEGF和IGF-1分泌量較正常來源的明顯降低。Liu等[9]利用高糖培養多功能前體細胞后，VEGF的分泌量也可以得到類似的結果，但是其細胞來源為正常的幼年大鼠。在本實驗中所采用的干細胞培養條件為正常的培養條件，說明糖尿病的體內環境對糖尿病來源的干細胞其分泌能力有不可逆的損害作用。另據研究表明，VEGF和IGF-1在糖尿病患者的腎臟和視網膜以及血液中的濃度明顯高于正常水平[10]，但是糖尿病自身來源的BMSCs所分泌的VEGF和IGF-1較正常的明顯降低，造成這種矛盾的結果，可能是不同的組織來源的細胞對于糖尿病內環境的反應性不同，并且VEGF和IGF-1在糖尿病腎病和視網膜病變等糖尿病并發癥的發展中起著重要的作用。至于細胞移植后分泌的細胞因子，是否會加速糖尿病并發癥的發展進程，需要更深入地研究。
影響干細胞治療心梗療效的另一重要因素是在干細胞移植后細胞在心梗區的存活率較低，而心肌梗死區缺血低氧的環境是導致細胞凋亡的主要原因。我們采用體外低氧無血清的方法建立細胞凋亡模型[11]，發現糖尿病組的抗凋亡能力明顯較正常組下降?，F有的體外研究表明，體外的高糖、丙酮醛類、活性氧產物（ROS）等環境對細胞的凋亡起著很大的促進作用，而這些因素在糖尿病患者中均存在。另外，VEGF的分泌減少和糖尿病BMSCs在體外培養條件下的所表現出細胞衰老的形態學特征，抗細胞凋亡能力的下降也起著重要的促進作用。
目前關于糖尿病大鼠來源的BMSCs在增殖、分泌和抗凋亡能力下降方面的確切機制目前尚不清楚，可能與糖尿病體內復雜的病理生理條件造成干細胞的線粒體功能障礙[12]、高糖所導致的細胞復制性衰老[3]和相應的信號通道阻斷等有關[9]。在本實驗中，我們選擇均為同齡的大鼠作為實驗對象，避免了因年齡不同而造成的誤差；在細胞培養方面，均在體外正常的培養條件下進行，從而可以得出糖尿病對BMSCs的各種生物學性狀的損害是客觀存在的。
本研究也存在若干不足，如沒有將培養得到的糖尿病BMSCs移植回動物心梗模型體內，檢測其對心功能的改善情況。另外，在糖尿病來源的BMSCs在抗凋亡能力、增殖能力和分泌能力損傷的機制上，沒有做進一步的探討，這也是我們下一步實驗的方向。
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[關鍵詞] 單細胞； 有限稀釋法； 舌癌干細胞； 完全克隆
[中圖分類號] Q 21 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干細胞是癌組織中一小群具有干細胞特性的細胞，具有自我復制與更新的能力，而且增殖與分裂能力極強，少量細胞即可形成體外移植瘤[1]。近年
有關腫瘤發生、轉移、耐藥與復發等諸多難題均從癌干細胞的角度進行研究。這種研究的基礎和前提是明確癌干細胞的標志或分離出癌干細胞，以提供研究的靶細胞。目前已發現多種永生性癌細胞系中存在有癌干細胞，Tca8113M1舌癌細胞系同樣可能存在有癌干細胞，可以作為舌癌干細胞的研究對象。鑒于癌干細胞獨特的自我復制與更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌細胞系為研究對象，采用有限稀釋法分離出單個舌癌細胞進行體外培養，利用癌干細胞的自我復制能力進行分裂增殖，形成預期的單細胞克隆，進一步形成細胞亞系，以此證明Tca8113M1
舌癌細胞系中存在癌干細胞的可能性，同時檢測細胞亞系癌干細胞標志的表達情況，觀察不同細胞亞系的生物學特性，并且動態觀察單細胞培養中細胞克隆形成的規律，為從Tca8113M1細胞系中分離舌癌干細胞提供前期實驗依據。
1 材料和方法
1.1 舌癌細胞系來源
人舌癌細胞系Tca8113由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤生物實驗室建系，四川大學華西口腔醫院贈送。右江民族醫學院腫瘤分子生物學實驗室在此基礎上建立了轉移人舌癌細胞系Tca8113M1[2]。
1.2 主要試劑和儀器
胎牛血清（Hyclone公司，美國），RPMI1640培
養基（Gibco公司，美國）；PE標記抗人CD44抗體，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的抗人細胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-
gen，ESA）抗體，PE/cy5標記抗人CD184抗體，同
型對照抗體分別為大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1與小鼠IgG2aκ4。CO2培養箱（日本三洋公司），流式細胞儀（BD公司，美國），倒置顯微鏡（Olympus公司，日
本）。
1.3 體外單細胞培養、建系及細胞克隆生長的動態
觀察
采用有限稀釋法進行體外單細胞培養與建系。Tca8113M1細胞經復蘇后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。用0.25%胰蛋白酶消化細胞制備細胞懸液，轉移至96孔板，采用有限稀釋法保證每個孔有1個細胞，在倒置顯微鏡下觀察其生長和增殖情況，待其生長成多個細胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化轉移至6孔板擴增培養后，在培養瓶中反復傳代建立細胞亞系。此外，在此培養過程中動態觀察單個細胞形成細胞克隆的形態與生長情況，觀察時點分別為3 d和1、2、3周。
1.4 舌癌細胞亞系成瘤性檢測
建立裸鼠皮下移植瘤模型。體外培養Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌細胞亞系細胞，選取形態良好的生長期細胞，在生長旺盛時接種。具體步驟如下：消化收集舌癌細胞，800 r?min-1離心3～
5 min，棄上清液，計數細胞總量，以含10%胎牛血清的DMEM培養液按每毫升1×107個細胞的密度稀釋細胞；消毒裸鼠右腋窩的皮膚，將細胞接種于皮下，以皮下結節直徑超過1.0 cm為成瘤標準。共接種裸鼠45只，具體分組如下：1）Tca8113M1舌癌細胞亞系組，共12個亞系，每組3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌細胞組，6只，為母系細胞系對照組；3）Tca8113舌癌細胞組，3只，為來源細胞系對照組。
1.5 流式細胞術檢測舌癌細胞亞系癌干細胞相關標
志CD44、CD184、ESA的表達情況
將舌癌細胞（密度為每毫升1×106個）消化以后，800 r?min-1離心5 min，棄上清液，加入D-hanks液重懸，盡量將細胞吹散，將細胞懸液分別移入試管中（每管體積為500 μL），設置對照管和樣本管。在對照管中加入同型對照抗體（分別是大鼠IgG2bκ2、小鼠
IgG1與小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在樣本管中加入熒光抗體（PE標記抗人CD44、FITC標記抗人ESA、PE/cy5
標記抗人CD184）各5 μL，置于避光環境下室溫孵育30 min，然后于流式細胞儀上檢測CD44、CD184、ESA的表達情況。
2 結果
2.1 Tca8113M1細胞體外單細胞建系培養
Tca8113M1單細胞培養12 h后，細胞貼壁；24 h后部分細胞出現變大變薄、空泡樣變等老化現象；3 d后，有7個孔的細胞出現增殖分裂現象；7～10 d后有12個孔的細胞開始增殖為單個或數個完全細胞克隆（克隆形成過程見圖l）。
培養4～6周后，細胞基本達到穩定生長并增殖的狀態，以癌細胞的克隆樣生長為主，細胞呈鋪路石狀，可見巨核、多核細胞，核分裂象多見。待培養孔接近80%鋪滿時，將細胞轉移至6孔板上擴增培養，1～2周后轉移至培養瓶中繼續傳代培養，穩定傳代30代后凍存。本研究以有限稀釋法獲取192個Tca8113M1舌癌單細胞，并在96孔板中進行體外傳代建系培養，獲取12個細胞亞系，比例為6.25%，分別命名為Tca8113-S1～Tca8113-S12。
2.2 Tca8113M1細胞體外單細胞培養形成細胞克隆
的動態觀察
以3 d和1、2、3周為觀察時點，發現單個細胞形成細胞克隆的形態主要有3種：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12細胞亞系的細胞均源于單個細胞形成的完全克隆，均可以進行連續傳代與細胞培養擴增，而其他單個細胞培養形成的部分克隆與旁克隆則在后續培養中逐漸衰老與消亡，未能連續傳代進行細胞擴增。3種克隆在培養過程中的變化情況如下。1）完全克?。杭毎g緊湊密集成型，增殖速度快，其中1～2周為典型的完全克隆狀，3周時在細胞克隆中央出現細胞重疊生長現象（圖2中A1～A4）；2）部分克?。嚎寺⌒螒B界于旁克隆與完全克隆之間，細胞間較疏松，其中1～2周為典型的部分克隆狀，但第3周細胞克隆疏松，形狀消散，
有轉變為旁克隆的趨勢（圖2中B1～B4）；3）旁克?。?/p>
細胞間疏松不成型，第1周較典型，第2、3周后細胞老化（圖2中C1～C4）。
2.3 Tca8113M1舌癌細胞亞系成瘤情況
將舌癌細胞亞系Tca8113-S1～Tca8113-S12接種于裸鼠皮下后，1周后可觸及皮下結節，表面光滑、質硬、可活動；2周后可見皮下結節生長迅速；3～4周后皮下結節最大直徑達1.0 cm以上。含對照組在內的45只裸鼠均接種成瘤，成瘤率為100%。
2.4 流式細胞術檢測細胞亞系癌干細胞相關標志
CD44、CD184、ESA表達情況
流式細胞術檢測結果見表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6與Tca8113-S10的ESA陽性表達率分別為60.7%±3.6%、74.1%±1.5%與65.3%±2.8%外，其余細胞亞系ESA的陽性表達率均在80%以上；各亞系CD44陽性表達率均很高，除了Tca8113-S7為68.9%±2.4%外，其余亞系的陽性率均在90%以上；12個亞系的CD184表達存在差異，陽性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之間波動。
3 討論
本研究利用有限稀釋法等經典的細胞培養技術，以舌癌Tca8113M1細胞系為研究對象，隨機選取192個舌癌細胞，在96孔板中進行單細胞培養，經過長期傳代培養，共建立12個舌癌Tca8113細胞亞系，比例為6.25%，而且都具備很強的成瘤性。進一步檢測12個Tca8113細胞亞系的癌干細胞相關標志，結果發現：CD44與ESA均為高水平表達，陽性表達率多在90%左右，而CD184的陽性表達率則各有不同。據此結果可以結合癌干細胞的生物學特性對本實驗獲得的細胞系進行分析。
本研究發現：舌癌Tca8113M1細胞系中有6.25%的單個細胞可以進行自我分裂、增殖，形成細胞亞系。還有研究[3]發現：Tca8113細胞連續經過兩次單細胞培養實驗，其中具備分裂增殖活性的細胞比例為5.09%～10.85%。這提示即使在永生化細胞系中，具備持續增殖能力的細胞占整個群體的比例都較少。根據目前的文獻[4]報道，在癌細胞群或組織中，癌干
細胞比例為0.01%～5%；體外培養的永生化癌干細胞系中，癌干細胞的比例可能偏高一些。本研究采用經典的有限稀釋法獲取單個細胞，這種細胞表現出強大的增殖與分裂活力，而且還形成了成瘤性很強的細胞亞系。這些單個培養的細胞是否就是癌干細胞尚需進行單細胞水平的鑒定，但可以大膽推測的是，其中應該包含有癌干細胞。腫瘤干細胞的概念于20世紀60年代提出，并據此建立了腫瘤細胞克隆實驗。本研究在單個細胞培養中也發現，單細胞的增殖方式是克隆樣增殖，即形成一個細胞克隆后擴大生長，并且在周圍形成小的細胞克隆，最后融合成片，但究其細胞來源就是一個癌細胞而已，所有后續的細胞克隆與癌細胞就是源于它，所以可以認為該細胞具有癌干細胞的潛質，可以考慮從癌細胞系中篩選癌干細胞。
在12個Tca8113細胞亞系中，為明確其癌干細胞相關標志的表達情況，為后續舌癌干細胞的篩選提供前期實驗數據，本研究綜合文獻報道，選取了CD44、ESA與CD184等癌干細胞相關標志進行檢測。CD44是乳腺癌、頭頸部腫瘤、結腸癌等上皮組織的癌干細胞的相關標志，CD184是胰腺癌干細胞的相關標志；ESA則是上皮來源的癌干細胞標志，而且屬于細胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12個細胞亞系中，
CD44與ESA均處于高水平表達，而CD184的表達則高低不一，其中亞系間均數差值最大者接近60%。從這3個指標的表達情況來分析，可以進行如下推測：1）CD44與ESA是不同細胞亞系共有的標志，提示這些細胞亞系可能具有共同的組織起源；2）CD184的差異性表達提示Tca8113細胞系中存在細胞異質性，但從其比例來看，大致有3個等級，即15%、30%、50%以上，提示其生物學特性可能有明顯的差別，但可作為舌癌干細胞研究的候選細胞群體進行研究。
此外，在單個細胞培養基礎上建立細胞亞系的過程中，筆者發現單個細胞形成細胞克隆的形態與細胞最后成系關系密切。在單個細胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3種克隆形式中，只有完全克隆能夠形成細胞亞系，而且這些細胞亞系表現出腫瘤的異質性與成瘤性，而部分克隆以及旁克隆則在傳代與擴增培養過程中逐漸老化或消亡。這一結果可進行逆向推理：將最初形成完全克隆的12個細胞確定為舌癌干細胞，而其形成的完全克隆則是癌干細胞自我更新與增殖的結果，其中可能富含癌干細胞。這一觀點也為前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神經膠質瘤等相關研究[7-12]所證實。這些研究發現完全克隆細胞可以高表達癌干細胞標志；接種1 000個完全克隆前列腺癌細胞就可形成移植瘤；通過懸浮球培養的癌細胞球在消化后進行單細胞培養，可以形成高比例的完全克隆。有學者[13]進一步在頭頸腫瘤細胞系中發現，CD133與CD44陽性表達的癌細胞多形成完全克隆，而CD133與CD44陰性的癌細胞則多趨向于形成部分克隆或旁克隆，從而認為CD133與CD44是頭頸腫瘤癌干細胞的標志。由此可見，完全克隆為癌干細胞的自我更新方式與富集、純化癌
干細胞及癌干細胞標志的研究提供了新的途徑，近年在癌干細胞研究中逐漸被應用和關注[11]。此外，針對完全克隆的研究切入時間與方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在單個細胞培養1～2周時形成，最好不要超過3周；擴增培養后，可使癌干細胞比例減少或分化細胞比例增加，從而影響對癌干細胞行為學的觀察。
本研究屬于尋找舌癌干細胞的前期性和階段性實驗，但是結果很有意義，這12個細胞亞系表明了Tca8113M1細胞系中有存在舌癌干細胞的可能性，而其最初的來源細胞系Tca8113也應存在癌干細胞。結合細胞克隆形態分析的單個癌細胞培養模式可為深入研究舌癌干細胞提供細胞研究平臺。
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1978年，羅伯特•愛德華教授和同事一起成功地使第一例試管嬰兒誕生，從此開創了生殖醫學領域的新紀元。試管嬰兒在20多年前也曾被世界輿論界視為洪水猛獸而大加抨擊，但時至今日，這項技術已經被全世界絕大多數國家承認，堪稱醫學史上的一大奇跡。迄今為止，全球已有上百萬試管嬰兒誕生。
被譽為“試管嬰兒之父”的英國劍橋大學教授羅伯特•愛德華說：“克隆單純從技術上講非常簡單，就是把卵細胞中DNA去掉，然后將體細胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個試管嬰兒實驗室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險?！?/p>
本文以此熱點問題作為命題材料，對2011年高考生物試題進行單項預測。預測材料及其涉及的知識、試題如下：
1．試管嬰兒
【知識鏈接】要做好有關“試管嬰兒”的試題，除了書本上的知識外，還要掌握“試管嬰兒”技術的有關知識。“試管嬰兒”技術是通過將不孕夫婦的和卵細胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養使其發育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內使其發育成胎兒。
體外受精步驟包括：的采集與培養、卵母細胞的獲取與培養、體外受精等操作技術。具體過程如下圖:
哺乳動物胚胎發育的過程大體概括如下圖：
例1 下列關于關試管嬰兒的說法，不正確的是（）
A. 從良種母牛體內采集的卵母細胞都需要進行體外培養
B. 從良種公牛采集的需進行獲能處理
C. 早期胚胎移植的意義在于提高優良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵發育至原腸胚時期的胚
解析：本題考查了試管嬰兒的相關知識。根據體外受精和胚胎發育過程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發育至囊胚時的胚。
答案：D
例2 據2008年1月17日《干細胞》雜志報道，某科學家使用了進行試管受精的年輕女性捐獻的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細胞，成功克隆出了5個人體胚胎，進而可以開發出有研究價值的干細胞。請回答：
（1）上述過程中主要應用到的兩項動物細胞工程技術為；若將某經過修飾的基因導入其中的部分胚胎干細胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培養基進行胚胎干細胞培養時，通常需要加入等天然成分；在細胞培養時，要保證被培養的細胞處于一定的氣體環境，所需要的氣體主要有 。
（3）科學家欲進行胚胎分割移植，則應該選擇發育良好、形態正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養皿中，然后用分割針進行分割。
答案：（1）動物細胞培養、細胞核移植顯微注射技術（法）
（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知識鏈接】克隆人的基本原理是動物細胞核的全能性，包括胚胎細胞核移植和體細胞核移植。其基本過程為：
細胞核移植技術中注入去核卵母細胞中的不是供體細胞核，而是整個細胞，伴隨著兩細胞融合，體現細胞膜的結構特點：具有一定的流動性。該技術形成重組細胞繼而發育成一個新個體，體現了細胞核的全能性而非動物細胞的全能性。
例3 下圖為克隆人的示意圖，據圖回答：
（1）圖中所涉及的現代生物技術有、和
等。
（2）下列有關胚胎移植的敘述正確的有（）
A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子
B.只有供、受體生理環境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續發育
C.供體和受體要進行免疫檢查，防止發生免疫排斥反應
D.不同動物其胚胎移植的時間不同，人的胚胎移植最好在四個細胞階段進行
（3）圖中兩個嬰兒長大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說明 具有全能性。
（4）使用培養基進行胚胎干細胞培養時，通常要加入等天然成分，除了保證被培養細胞處于無菌、無毒及充足氧氣的環境中，還需要保證細胞生活所需的；早期胚胎發育在階段以前的細胞是全能細胞。
（5）圖中從“內細胞團到胚胎干細胞”的培養過程中，必須用處理內細胞團，使之分散成單個細胞。干細胞形成組織、器官必須要進行 和 。
（6）在體外培養胚胎干細胞能否獲得動物器官?
。為什么？
解析：（1）該圖利用了細胞核移植、動物細胞培養、胚胎分割移植等技術。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態，才能保證胚胎的正常發育。（3）克隆過程說明動物細胞核具有全能性。（4）動物細胞培養液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。動物細胞培養的條件：無菌、無毒的環境；營養物質（合成培養基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動物細胞培養過程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個細胞。（6）胚胎干細胞在體外培養條件下一般只能增殖進行細胞分裂，不能發生細胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 細胞培養（另外寫細胞融合、胚胎分割也對，寫了三個則給滿分）（2）ABD（3）動物體細胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細胞在體外培養條件下可以增殖而不發生分化
3．生物技術中的倫理問題
【知識鏈接】生物技術引發的倫理問題包括克隆技術引發的倫理問題、試管嬰兒引發的倫理問題、基因檢測引發的倫理問題。中國政府對于克隆技術的態度是禁止生殖性克隆人，不反對治療性克隆人；對于試管嬰兒的態度，中國衛生部的規定是實施體外受精、胚胎移植及衍生技術必須獲得衛生部的批準證書。
例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過程。請回答下列問題：
（1）圖中①為 細胞，過程A是目前實現體細胞克隆的關鍵技術，該技術稱為 。
（2）圖中③能誘導分化出神經細胞、血細胞、肌肉細胞，其根本原因是 的結果。這樣培育得到的組織器官進行自體移植的最大好處是 。
（3）若應用轉基因技術治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因導入結構④中的
，原因是這些細胞 。
（4）在用PCR技術擴增胰島素基因時，緩沖溶液中必須加入的物質有：、分別與兩條模板鏈結合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。
（5）我國政府禁止生殖性克隆，但不反對治療性克隆研究。為什么要反對生殖性克隆（即克隆人）呢？請你寫出一條理由： 。
解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細胞的核與卵細胞的細胞質進行重組， 形成重組細胞，將重組細胞經過培養得到囊胚，取囊胚內細胞團培養得到不同組織器官，可用于進行自體移植，不會產生免疫排斥反應。
答案：（1）次級卵母（卵） 核移植
（2）基因選擇性表達不會產生排異（免疫排斥）反應
關鍵詞： β細胞素; 糖尿病 胰腺干細胞
胰島移植是治療糖尿病的一個熱點, 但供體的缺乏和存在免疫排斥反應限制了其應用。胰腺干細胞能定向分化成胰島細胞, 這為胰島移植提供了新的材料來源［1］。細胞生長因子在干細胞的發育和分化中發揮了重要作用。研究表明, β細胞素（betacellulin, BTC）屬于表皮細
胞生長因子家族中的一個成員, 具有多種生物學功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表達, 提示BTC可能在胰腺組織的發育中發揮重要的生理作用［2, 3］。本研究中通過建立穩定的胰腺干細胞體外培養方法, 將β細胞素用于胰腺干細胞的體外培養, 觀察其是否能促進胰腺干細胞轉分化為成熟的胰島, 為克服胰島移植時的供體短缺提供新的胰島來源。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（體質量250 g, 雌雄不限, 飼養于清潔級動物房自由飲水和進食, 手術前1 d禁飲食）由第四軍醫大學動物中心提供, Ⅴ型膠原酶、 Histopaque(1.119 kg/L)、Histopaque(1.098)(kg/L)、 Histopaque(1.077 kg/L)、 堿性成纖維細胞生長因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF2)、 角朊細胞生長因子(keratinocyte growth factor, KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)購自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 購自杭州四季青生物制品公司; 雙硫腙（dithizone, DTZ）、 二甲基亞砜（DMSO）、 煙堿購
于華美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗體購自北京中山生物工程有限公司; 免疫組化SP檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 購于Gibco公司; 胰島素放射免疫分析試劑盒購于北京北方生物技術研究所; 大鼠β細胞素由本研究室采用基因工程方法獲得［4］。
1.2 方法
1.2.1 大鼠胰腺干細胞的分離、 培養
采用宋振順等［5］的方法, 首先以Ⅴ型膠原酶消化成年SD大鼠胰腺組織, 然后采用非連續密度梯度離
心法純化消化后的胰腺細胞, 去除胰島細胞后, 收集外分泌部細胞進行培養。所獲的細胞培養在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培養液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L鏈霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天將培養液改為DMEM/F12, 其中加入ITS（5 mU/L胰島素+5 mg/L轉鐵蛋白+5 mg/L硒）500 μg/L二性霉素B, 2 g/L牛血清白蛋白、 10 mmol /L煙堿, 0.01 ng/L KGF等。此后每2～3 d換液1次。于相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況和克隆形成情況。
1.2.2 胰腺干細胞免疫組織化學染色
分別取培養3、 7、 14 d后的細胞爬片, 0.4 g/L多聚甲醛(PFA)固定后, PBS緩沖液沖洗玻片, 分別與兔抗小鼠PDX1、 CK19 抗體4℃反應過夜, 二抗及呈色反應參照SP試劑盒說明。二氨基聯苯胺(DAB)顯色, 顯微鏡觀察, 自來水沖洗, 蘇木精復染, 中性樹膠封固。陰性對照用PBS代替一抗。
1.2.3 雙硫腙染色與計數
雙硫腙(DTZ)為螯合劑, 可與鉛、 銅、 鋅等螯合, 人和動物（豚鼠除外）的胰島β細胞因含有鋅, 雙硫腙染色呈猩紅色, 其他胰島細胞不著色。配制及染色方法: 用二甲基亞砜（DMSO）配制: DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO, 用Hanks（pH7.8）1∶100稀釋, 0.22 μm濾膜過濾, DTZ與胰腺干細胞培養后轉分化形成的克隆混合, 室溫5～10 min后做鏡檢。按胰島的直徑>50 μm計數染色的胰島樣細胞團, <50 μm者不計。
1.2.4 胰島素檢測
胰腺干細胞轉分化后形成的胰島克隆對葡萄糖刺激有胰島素分泌反應。顯微鏡下挑取100個胰島樣細胞團克隆, 培養于24孔培養板, 先用含低糖（5.5 mmol/L）的DMEM/F12培養液在37℃下孵育1 h后, 更換為含高糖（16.7 mmol/L）加煙堿（10 mmol/L）的DMEM/F12培養液在37℃下孵育2 h后, 取培養液上清, 采用放免法測定胰島素含量。
1.2.5 實驗分組
按照實驗方法1.2.1中胰腺干細胞的培養方法培養大鼠胰腺干細胞, 并將其設為正常對照組, 各實驗組中分別加入不同濃度的大鼠β細胞素, 依次為10、 20、 30、 40、 50 mg/L, 共設立5個實驗組。
1.2.6 統計學處理
采用Student t檢驗方法, 應用SPSS10.0統計軟件完成統計學分析。
2 結果
2.1 成人胰腺導管上皮細胞光鏡下形態學變化
干細胞是指具有自我更新能力和增殖分化能力的一類細胞，目前學習者對動物干細胞的理論和應用知識掌握較多。由于植物細胞的全能型，長期以來很多學習者誤認為植物中不存在干細胞，再加上教師對干細胞這部分內容的講授不透徹，造成學習者對植物干細胞、動物干細胞及植物愈傷組織細胞的概念往往混淆不清，存在植物干細胞認知上的錯誤，因此很有必要對植物干細胞的相關知識進行總結。
1.植物干細胞
1.1植物干細胞的概念和特征。植物干細胞是位于植物分生組織中固有的未分化細胞，具有自我更新和再生能力。植物干細胞具有很強的自我更新能力，并且可以分化為特化的細胞類型，這些特化的細胞產生新的植物器官（根、莖、葉和花等）。這些細胞表型的變化是由影響植物功能的基因表達變化引起的，受到內源性和外源性的信號共同調節[1]。植物干細胞的特征包括：能夠形成所有分化細胞的類型；具有自我更新的能力，維持干細胞的數量；位于分生組織。
1.2植物干細胞與動物干細胞的比較。在動物中，通常將干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞具有全能性，它可以分化形成所有的成體組織細胞，甚至發育成為完整的個體；成體干細胞（如造血干細胞、神經干細胞、間充質干細胞、皮膚干細胞等）大多為多能干細胞，它們具有多向分化的潛能，可以分化形成除自身組織細胞外的其他組織細胞，真正具有全能性的細胞是受精卵和其分裂產生的子細胞。與此相比，許多植物干細胞具有旺盛的再生能力，在干細胞的整個生活周期中能使植物生長并且產生新的器官（如植物莖端分生組織中的干細胞和根端分生組織中的干細胞）[2]。
1.3植物干細胞與植物愈傷組織細胞的比較。植物愈傷組織細胞是由成體細胞經過脫分化而形成的具有分化能力的細胞，雖然愈傷組織的分化能力與植物干細胞相似，但它們在來源、細胞分化和增值能力等方面是不同的。植物愈傷組織細胞來源于異質性的體細胞，它是體細胞對損傷的暫時響應，是一個臨時獲得刺激的細胞，盡管愈傷組織具有干細胞樣屬性，但愈傷組織不易維持穩定的細胞分裂[3]。而植物干細胞來源于植物分生組織的同質性細胞，它們在植物的整個生命周期可以產生并形成新的組織和器官。
2.植物干細胞的類別與調控
根據分生組織的種類，植物干細胞可分為莖尖分生組織中的干細胞和根尖分生組織中的干細胞。
2.1莖尖分生組織中的干細胞。莖尖分生組織包括中心區和中心區下方的帶狀區。中心區包括上部干細胞區和下部的組織中心（即干細胞區下部靠近帶狀區的小細胞群）。干細胞分裂時上部的干細胞分裂成兩部分子細胞，一部分干細胞后裔留在中心區并保持多能性；另一部分細胞則離開莖尖分生組織的中心區，但保持較快的分裂速度，最終分化為葉或者花原基器官，為側生器官的生長和分化提供保證[4]。目前已知的位于干細胞周圍“組織中心”的WUS（WUSCHEL）是保持莖尖干細胞特征的必要信號分子，它參與對莖尖干細胞的穩態調控，使整個植物莖尖干細胞保持連續不斷的自我更新和分化。
2.2根尖分生組織中的干細胞。靜止中心位于根尖分生組織中心，干細胞則圍繞在靜止中心細胞周圍。靜止中心作為組織中心維持周圍干細胞的穩定和功能，靜止中心周圍的干細胞分布于中柱鞘外側，維管干細胞形成維管組織、皮層/內皮層干細胞，進而形成皮層、內皮層與根冠干細胞，然后形成根冠細胞。目前已知的WOX5（WUS-RELATED HOMEOBOX 5）作為最主要的干細胞決定因子，特異的表達于根端分生組織的靜止中心，參與對根端干細胞的穩態調控，使整個植物的根尖干細胞保持連續不斷的自我更新和分化[4]。
3.植物干細胞的應用
3.1生產天然產物，開發藥品或者化妝品。傳統的植物細胞培養存在細胞生長緩慢、生產成本高等問題，而植物干細胞培養具有遺傳穩定、細胞生長率和生長模式穩定、凝集程度低等優點，可以用來大量生產有用的植物天然產物，并用于藥品、功能性食品、化妝品中。如懸浮培養紫杉干細胞可以生產松香烷型三環二萜、美麗紅豆杉素A和美麗紅豆杉素B等產物，以達到抑制腫瘤血管的生成和抗癌作用，而且其產值遠大于傳統細胞培養的產值，具有很好的開發前景[5]。
3.2植物細胞系庫的建立和利用。一般的植物細胞凍存后存活率低，恢復生長能力慢，因此限制其在植物細胞培養中的應用。植物干細胞系在低溫儲藏方面有很大的優勢，不僅有高的存活率，而且在低溫儲藏前后遺傳物質沒有變異，是植物細胞系庫建立的很好材料。細胞系庫的建立不僅會使研究材料的供應得到滿足，而且使植物細胞系的研究周期縮短，并在植物種子資源的保存和利用方面發揮重要作用[6]。除了以上應用外，利用植物干細胞還可以進行植物干細胞的分子調控機制和分子設計育種等方面的研究。
4.結語
植物干細胞是位于植物分生組織中固有的未分化細胞，它們具有自我更新和再生能力。根據目前學習者對植物干細胞認識不足的實際，本文對植物干細胞、動物干細胞及植物愈傷組織細胞的概念進行了辨析，并對植物干細胞的分類及應用進行了論述。學習者清楚植物干細胞、植物愈傷組織細胞和動物干細胞的概念后，在學習植物干細胞的理論和應用等方面時才能正確理解相關的知識點。
參考文獻：
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[3]游云，蔣超，黃璐琦.試析植物干細胞與動物干細胞的異同[J].中國中藥雜志.2014，39（2）：343-345.
【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞；肝干細胞；細胞移植
骨髓間充質干細胞(MSCs) 具有多向分化潛能，可以在體外誘導分化出肝干細胞，此種骨髓源性肝干細胞可以為肝組織移植工程提供新的細胞來源。近年來的研究主要集中于體外誘導MSCs為肝干細胞，此種細胞具備了肝細胞的形態，在體外能夠表現出一定的肝細胞功能〔1〕，但對骨髓源性肝干細胞在體內的定居和定位能力情況尚不明確。本實驗通過對大鼠MSCs進行體外培養，誘導、分化出肝干細胞，同時建立暴發性大鼠肝衰竭模型，探討骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況。
1 材料與方法
1.1 材料
低糖DMEM培養基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝細胞生長因子（HGF)(CYTOALAB公司)、細胞培養箱(Forma公司)；純系SD大鼠、3周齡、體重100～120 g(供體大鼠)和成年純系SD雌性大鼠、體重180～220 g(受體大鼠)，由吉林大學實驗動物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干細胞培養
1.2.1 MSCs分離、培養及定向肝干細胞的誘導分化
從供體SD大鼠股骨提取骨髓細胞。用比重1.073的Percoll分離液行MSCs分離，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培養和擴增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)誘導定向肝干細胞分化。
1.2.2 誘導后的骨髓源性肝干細胞鑒定
用ELASA法檢測細胞培養液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫組化法檢測細胞中細胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表達。
1.3 肝損傷動物模型的制作和分組
受體雌性SD大鼠20只，隨機分為正常大鼠組和肝損傷組。肝損傷組用質量濃度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔內注射，劑量1 200 mg/kg體重。
1.4 同種異體大鼠骨髓源性肝干細胞移植
正常組大鼠和肝損傷組大鼠，分別以戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，常規消毒、備皮、鋪無菌巾，上腹正中切口，長約1 cm，于肝中葉以BD胰島素注射器注射肝干細胞懸液0.4 ml（107/ml )，觀察無出血后縫合傷口。
1.5 受體體內移植骨髓源性肝干細胞鑒定
應用PCR技術檢測性別決定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干細胞移植后1，2，4 w后取受體肝臟移植原位(注射部位)、鄰位(距注射部位0.5 cm)組織，應用PCR技術檢測〔2〕性別決定因子基因片段(Sry)。引物按文獻〔3〕設計，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物對SRY1/ SRY2擴增片段大小為317 bp，內引物對SRY3/SRY4擴增片段大小為121 bp。
2 結 果
2.1 骨髓源性肝干細胞的培養結果 大鼠MSCs經原代培養，細胞傳代，誘導分化，細胞異形性較誘導前增加，表現為圓形、橢圓形細胞數量較誘導前明顯增加，而梭形細胞數量減少，誘導培養10 d左右，細胞形態表現為圓形、橢圓形細胞為主，梭形細胞已極少見。免疫組化染色，二氨基聯苯胺（DAB)顯色，在倒置顯微鏡下，可見細胞形狀顯圓形或卵圓形，胞漿內出現棕黃色顆粒。CK18、CK19、Vimentin呈陽性表達。細胞培養液中AFP、ALB含量誘導前分別為(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；誘導后分別為(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。誘導后的AFP、ALB含量明顯高于誘導前（P＜0.05)。表明經誘導的MSCs分化為肝干細胞。見圖1。
2.2 肝損傷模型病理結果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝臟肝索紊亂，肝細胞腫脹變性、灶性及大片壞死，伴出血及炎性細胞浸潤。見圖2。
2.3 性別決定因子基因片段檢測結果
肝損傷組：檢測1 w時陰性，2 w時原位肝組織Sry陽性表達，鄰位未表達，而4 w時原位及鄰位組織檢測到Sry表達，原位表達較2 w時增強，鄰位較弱。正常肝臟組：1及2 w均未檢測到表達，4 w時檢測到原位微弱表達。見圖3。
3 討 論
MSCs具有多向分化潛能，特別是具有向肝臟干細胞、肝細胞及血管內皮細胞分化的潛能〔4〕，因而有望成為肝組織移植工程新的種子細胞來源。由于MSCs是成體干細胞，取材方便，可以來自患者自身，無排斥反應，故具有重要的臨床應用價值。本實驗根據文獻報道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化為肝干細胞，對骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況進行初步研究。
目前研究表明移植肝干細胞可存活于受體許多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、腸系膜、腎及腎脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝臟由于其獨特的營養環境、生理及解剖結構環境無疑是最理想的場所，可經門靜脈輸入或肝實質植入，該組實驗采用肝臟植入方法，取得較好效果，說明此方法是安全可行的。本實驗采用同種異體移植，應該考慮免疫排斥反應，但文獻報道，純化的MSCs具有獨特的免疫原性，進行同種異體移植不需要預先應用免疫抑制劑，無免疫排斥反應，是良好的基因治療靶細胞。
目前鑒定受體體內被移植后的肝干細胞有許多方法，其中較為常用的是以雄性動物為肝干細胞供體〔1〕，雌性動物接受細胞移植后，分化增殖的細胞 Y 染色體陽性，證明雌性受體內存活的細胞來自雄性供體細胞，這就可以清楚地將植入的細胞與原有的細胞區分開來，進一步研究移植作用，本實驗采用雄性供體細胞為雌性受體移植，檢測移植部位細胞的Y染色體表達情況，進而檢測移植細胞是否定植。
實驗結果顯示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位檢測到表達，4 w表達明顯增強，而且臨近部位出現表達；正常大鼠在移植后4 w移植原位出現微弱表達。實驗證實，骨髓源性肝干細胞在正常大鼠肝臟及肝損傷大鼠肝臟內均能定居，但在肝損傷大鼠肝臟內定居能力明顯增強。考慮可能為大鼠肝損傷后，刺激機體分泌出各種促進肝細胞再生的生長因子，為移植細胞提供定居所需的微環境。文獻報道，在正常大鼠體內，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝損傷時，啟動肝再生程序，這些因子才能被激活，引起肝細胞有絲分裂。
本文通過實驗證實了大鼠骨髓源性肝干細胞移植后可以定居于受體肝臟內，而且在肝損傷后有利于干細胞移植的定居，這為下一步研究定居于肝內的骨髓源性肝干細胞的功能奠定了基礎。
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