保險心得及感悟樣例十一篇

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篇1

【關鍵詞】 組蛋白脫乙?；?；血管緊張素Ⅱ；心肌細胞；肥大；反義脫氧寡核苷酸

心肌細胞肥大是一種復雜的、多種因素參與調節的動態過程，包括血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）在內的多種化學因素、多種機械刺激的作用都有可能導致心肌細胞的肥大。盡管對于其中的內在機制尚未完全明確，目前認為在心臟肥大的細胞信號傳導通路中，組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylases，HDACs）可能是一個重要的終極靶點〔1〕。HDACs分為三類，其中Ⅰ類HDACs被推斷認為有可能對于心肌肥厚發揮著促進作用，但目前有待于進一步明確〔2〕。本課題組以Ⅰ類HDACs之一——組蛋白脫乙酰基酶2(HDAC2）為著眼點，以AngⅡ刺激心肌細胞造成肥大，給予HDAC2反義脫氧寡核苷酸和HDACs抑制劑——丙戊酸進行干預。通過觀察HDAC2在這一過程中的變化，以求證其對心肌細胞肥大的促進作用；同時也可證明丙戊酸作為臨床上常用的一種抗癲癇藥物，對于心肌肥厚有一定的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

新生1～3 d Wistar乳鼠，由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。DMEM，美國Hyclone公司。兔多克隆抗體人HDAC2（H54）及羊抗兔抗體，美國Santa Cruz公司產品。丙戊酸鈉，美國Sigma公司。二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）試劑，TakaRa公司。相差光學顯微鏡，Nikon eclipse ts100。紫外透射檢測分析儀FS312，上海復生生物工程研究所。RTPCR引物和HDAC2錯義脫氧核苷酸序列由北京奧科公司合成。FuGENE 6，瑞士Roche公司。

1.2 FuGENE 6轉染反義脫氧寡核苷酸

按照FuGENE 6說明書進行操作。于無菌試管中預先放入97 μl無血清培養液，加入FuGENE 6 3 μl，室溫下孵育5 min。加入HDAC2反義脫氧寡核苷酸 2 μg形成混合物，混勻后均于室溫下孵育30 min。反義寡聚脫氧核苷酸(ASODN)序列為5′GATGGGAAGGAGAGCAGCACAG3′。

1.3 心肌細胞培養

取新生2～3 d Wistar乳鼠心臟，放入含無血清DMEM培養液的平皿中。去除心房心包膜及附屬大血管后，0.25%胰酶反復消化、取上清，將收集的上清液用2 000 r/min離心10 min。棄上清，在離心管中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，將細胞重懸，細胞計數。按細胞數2×105/ml接種于6孔板培養。細胞分為正常對照組、肥大組、反義組和丙戊酸組。肥大組、反義組和丙戊酸組均加入10-5 mol/L AngⅡ，AngⅡ終濃度為2×10-7 mol/L；反義組加入于上述HDAC2反義脫氧寡核苷酸混合物；丙戊酸組加入丙戊酸，其終濃度為10-3mol/L；正常對照組僅加入等量無血清培養液。加入AngⅡ后12 h和24 h進行以下檢測。

1.4 相差顯微鏡下觀察細胞面積變化

各組均隨機選取10個視野，每個視野隨機選取10個心肌細胞，在1 600倍下應用Motic Images 1.3軟件測量心肌細胞面積，計算平均值。

1.5 RTPCR檢測HDAC2 mRNA表達

以Trizol (Invitrogen公司產品)提取心肌細胞中的總RNA，用紫外分光光度計測總RNA純度和含量，按照TaKaRa RTPCR試劑盒說明書進行操作。HDAC2基因引物序列：上游：5′GCT CGA TGT TGG ACG TAT GAG AC3′；下游：5′ACC TCC TTC ACC TTC ATC CTC AG3′；擴增片段長度為364 bp。βactin基因引物序列：上游：5′TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG3′；下游：5′GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG3′；擴增片段長度為764 bp。逆轉錄條件：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，4℃ 貯存。PCR反應條件：94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，共進行30個循環；72℃ 7 min，4℃貯存。PCR產物經1%瓊脂糖電泳，經紫外透射分析拍攝電泳條帶。以βactin為內參照，結果以HDAC2/βactin比值表示。

1.6 免疫組化法檢測HDAC2蛋白表達

取出各組無菌細胞培養玻片，無菌冷丙酮固定20 min。置于0.3% H2O2中30 min抑制內源性過氧化物酶。加入一抗(兔多克隆HDAC2抗體)4℃過夜。加入二抗（羊抗兔抗體），室溫下2 h。DAB顯色。蘇木素復染。乙醇脫水，二甲苯脫乙醇，封片。鏡下觀察，HDAC2以細胞核棕黃色為陽性。采用鏡下隨機選取10個視野，分別計算HDAC2表達陽性心肌細胞的百分數。

1.7 統計結果

數據以x±s表示，采用SPSS 12.0軟件包進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 心肌細胞面積的改變

在1 600倍下，正常對照組、反義組和丙戊酸組心肌細胞面積在12 h、24 h點均低于肥大組，差異有統計學意義（P＜0.05）；但反義組和丙戊酸組心肌細胞面積仍高于對照組（P＜0.05）。反義組和丙戊酸組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。表1 各組心肌細胞面積的檢測（略）

2.2 HDAC2 mRNA表達檢測結果

正常對照組、反義組和丙戊酸組心肌細胞HDAC2 mRNA表達在12 h、24 h點均低于肥大組，差異有統計學意義（P＜0.05）；但反義組和丙戊酸組仍高于對照組（P＜0.05）。反義組和丙戊酸組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。表2 各組心肌細胞HDAC2 mRNA的表達(略)

2.3 HDAC2蛋白表達

正常對照組、反義組和丙戊酸組心肌細胞HDAC2蛋白表達在12 h、24 h點均低于肥大組，差異有統計學意義（P＜0.05）；但反義組和丙戊酸組仍高于對照組（P＜0.05）。反義組和丙戊酸組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。表3 各組心肌細胞HDAC2蛋白檢測結果(略)

3 討論

蛋白的乙?；腿ヒ阴；堑鞍谆钚哉{節的一種重要形式，通過乙酰化或去乙?；梢愿淖內旧|的結構或者是轉錄因子的活性，從而可以調節基因轉錄的活性。真核生物染色質的基本單位——核小體是由核心組蛋白和DNA組成，核心組蛋白的乙?；c去乙酰化是基因表達過程中重要的調控方式之一〔3〕。催化組蛋白去乙?；拿釜步M蛋白脫乙酰基酶分為三類，這三類HDACs中，僅前兩類與核心組蛋白的去乙?；嚓P，Ⅲ類HDACs則無此作用，因此目前認為僅前兩類參與對基因轉錄的調節〔4，5〕。研究結果顯示Ⅱ類HDACs在心肌細胞肥大過程中發揮一定的抑制作用〔2，6〕，并推斷Ⅰ類HDACs發揮著促進作用〔7〕。本實驗結果證實了Ⅰ類HDACs在這一過程中有一定的促進作用，與其他學者在大體動物實驗中的研究結果是一致的〔8〕。

目前對于HDAC2在心肌細胞肥大過程中發揮促進作用的具體機制尚未完全明確，結合其結構特點以及先前研究結果推測，HDAC2對基因轉錄的調節作用可能是通過參與輔阻遏物的形成而實現的。在輔阻遏物mSin3中，主要成分包括核受體輔助抑制因子(NcoR)、甲狀腺沉默介導因子(SMRT)、Sin3、組蛋白去乙?；?HDAC2)。該復合物與核受體、Mad/Max等轉錄因子結合，并且通過Sin3募集HDAC2到特定基因的調控區，通過對組蛋白去乙?；l揮抑制作用。另外，HDAC2與一種特殊的心臟特異性基因轉錄調節因子——Hop蛋白（Homeodomain only protein）有著密切關切〔7〕。具體內在關聯尚有待于深入研究。

另外，本文結果表明了HDAC2反義脫氧寡核苷酸和HDAC抑制劑對于心肌細胞肥大的抑制作用。丙戊酸是20世紀70年代開始應用于臨床的一種廣譜抗癲癇藥，多年的臨床實踐證實了丙戊酸的良好耐受性。其治療癲癇的作用機制為增強γ氨基丁酸(GABA)的抑制作用，穩定膜的興奮性，主要用于各種類型的癲癇發作，亦可用于癲癇持續狀態。但是直到近些年才發現丙戊酸還是一種選擇性Ⅰ類HDACs抑制物，而且這一抑制作用與其治療性抗癲癇作用不同。其對心臟肥大的抑制作用有著重要的意義，對于這方面的研究有必要進一步從臨床研究的角度加以證實。

參考文獻

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篇2

一氧化氮合酶

Role of the tetrahydrobiopterin in Myocardial preconditioning: Possible Involvement of Mitochondrial KATP Channels and Nitric Oxide Synthase

ZHONG Biao1, ZHONG Huan-qing2, CHEN Hai-sheng2.

1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou, Guangdong Province, 516000, China

2.Department of Cardiovascular Surgery, Gaozhou People’s Hospital, Maoming, Guangdong Province, 525200, China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of tetrahydrobiopterin(BH4),5-hydroxydecanoate (5-HD) and Nω- nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) on langendorff rabbit heart model. MethodsSixty-four mature rabbits were randomly divided into four groups. The hearts in vitro removed to Langendoff equipment, then perfused with different buffer solution base on the Krebs-Henseleit buffer(KHB) for 30min. Then cardiac arrest was induced for 30min followed by 60min reperfusion. Coronary flow(CF) was recorded. Coronary effluent solution was collected for CK measurion. The dynamic change of myocardial NO content was measured. ResultsBy the treatment with BH4, CF was significantly increased, and CK was decreased than other groups after reperfusion(P

【Key words】 Tetrahydrobiopterin; Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury; ATP-Sensitive Potassium Channels; Nitric Oxide Synthase

BH4是所有NOS同功酶的輔助因子，具有穩定NOS結構、穩定NOS活性二聚體、增加L-精氨酸和NOS結合力、促進NO的合成與釋放等作用，與內皮功能密切相關[1,2]。外源性補充BH4能保護缺血再灌注心肌[3]，但是具體作用機制仍不清楚。本實驗通過觀察四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin, BH4)、5-羥基癸酸鹽(5-hydroxydecanoate, 5-HD) 和左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)對缺血再灌注心臟冠脈流量（coronary flow, CF）、一氧化氮(nitric oxide, NO)含量、肌酸激酶（creatine kinase, CK）的影響，研究線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel, mitoKATP) 、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)對四氫生物蝶呤減輕心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）作用的影響，探討四氫生物蝶呤保護缺血再灌注心肌作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組

健康成熟的大白兔64只(廣東醫學院動物中心提供，體質量2.0~2.5 kg，雄雌各半)，隨機數字表法隨機分入對照組（組Ⅰ）和BH4組（組Ⅱ）、BH4+ L-NAME組（組Ⅲ）、BH4+5-HD組（組Ⅳ），每組16只。

1.2 主要儀器和試劑

自制Langendorff離體心臟灌注裝置，全自動生化分析儀(美國Beckman公司, CX-4 型)，L-NAME、5-HD、BH4購自美國Sigma公司。NO檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.3 離體心臟Langendorff灌流模型

實驗動物3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，肝素鈉(150 IU/kg)抗凝后，迅速開胸取出心臟，立即浸入4℃ K-H液中，排盡殘血，連接于Langendorff模型灌注裝置上，以37℃ K-H液經主動脈插管逆行灌注30 min，灌注壓恒定為70 cm H2O，灌注液持續通入95%O2-5%CO2混合氣(流量3 L/min)。停搏前20 min BH4+ L-NAME組（組Ⅲ）、BH4+5-HD組（組Ⅳ）分別用加入L-NAME、5-HD的K-H液進行灌注10min。停搏前10 min BH4組（組Ⅱ）、BH4+ L-NAME組、BH4+5-HD組均用加入BH4的K-H液灌10 min。經30 min灌流后，灌注40 ml 4℃ St. Thomas心臟停搏液進行停搏，時間30 s。心臟停跳期間溫度保持在37℃~38℃。心臟缺血30 min后，以37℃ K-H液再灌注60 min。

BH4、5-HD、L-NAME最終濃度為10、100、100 μmol/L。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 在灌注10min、再灌注10 min、再灌注30 min、再灌注60 min4個時點收集冠脈流出液記錄冠脈流量CF。

1.4.2 全自動生化分析儀分析上述4個時點冠狀動脈流出液CK含量。

1.4.3 分別取缺血30 min、再灌注60 min的心室肌，硝酸還原酶法測定心肌組織NO含量。

1.5 統計學處理

數據以均值±標注差（ ±s）表示，用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。組間、組內數據比較均用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1與對照組相比，用含BH4的K-H液灌注的組Ⅱ再灌注后的CF、心肌組織NO含量增加(P

2.2使用含NOS抑制劑L-NAME（組Ⅲ）或mitoKATP抑制劑5-HD（組Ⅳ）預處理，與組Ⅱ相比，CF降低(P

3 討論

內、外源性NO在缺血預適應(ischemia preconditioning, IP)心肌保護中(包括早期、第二期)起重要作用，不僅是觸發因子，也是效應因子[4]。機體內產生的NO是由NOS催化非必需氨基酸左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg)和O2生成的。BH4是所有NOS同功酶的輔助因子 [1-2]。內源性NO的生成量嚴格依賴適當的BH4水平[5]。BH4水平的減少可導致NOS功能失調，產生過量的氧自由基而代替NO的產生，進而導致內皮和心肌細胞功能降低[6]。

CK絕大部分存在于心肌細胞胞漿內，心肌細胞以外含量甚微，是一種心肌特異性酶。所以，檢測冠脈回流液中CK的含量可以反映心肌酶漏出的程度，間接反映心肌損傷程度[7]。CF的多少則可反映冠狀動脈的擴張程度，從而觀察冠脈內皮細胞的功能和損傷程度。

mitoKATP被公認為是心肌保護作用中的一個關鍵環節[8]。mitoKATP的開放不僅參與IP的第一窗保護作用，而且也參與第二窗保護作用，不僅能作為啟動因子誘導IP，同時也是IP重要的效應器。它的開放能減輕MIRI [9]。

實驗結果提示外源性BH4可提高NOS的活性，促進內源性NO的產生，發揮NO對心肌和冠狀血管內皮的保護作用，減少CK的漏出，增加CF。表明BH4能增強冠脈系統的擴張，有利于停搏液在心肌的均勻分布和降溫，而在再灌注時則促進有害物質排出，減輕心肌酶的漏出，從而減輕心肌損傷，而這種保護作用也與mitoKATP的開放有關。

參考文獻

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