時間：2023-03-10 15:05:12
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據估計，全世界每年有2.2 萬的骨科、神經外科及口腔科患者因骨缺損行骨移植手術。目前常見的骨移植材料有自體骨、同種異體骨、脫礦化骨基質、異種骨、合成材料、組織工程產品等。自從滅活骨、脫鈣骨能夠誘導異位骨再生的現象被發現以來，科學家們認識到蛋白在誘導骨再生中起到關鍵作用，基于生物活性分子的骨組織工程成為研究的熱點。骨是高度血管化的組織，血管生成對骨再生至關重要。缺乏血管生成會導致骨再生中骨形成和骨總量減少。新生的血管對于營養供應、分子信號的傳輸和干細胞的運輸十分重要。血管生成對骨再生的意義重大，眾多學者嘗試利用促進血管生成的因子與骨再生的因子結合共同促進骨愈合。本研究試圖利用VEGF與BMP-2制備基因活化的仿生生物材料，觀察其對骨缺損的愈合中的促進作用。
1 資料與方法
1.1實驗分組 實驗分為5個組，包括：純殼聚糖/膠原支架，記為G1（group 1）；整合BMP-2腺病毒的殼聚糖/膠原支架，記為G2（group 2）；整合VEGF腺病毒的殼聚糖/膠原支架，記為G3（group 3）；整合BMP-2腺病毒和VEGF腺病毒的殼聚糖/膠原支架，記為G4（group 4）；以及整合BMP-2腺病毒和VEGF蛋白的殼聚糖/膠原支架，記為G5（group 5）。
1.2殼聚糖膠原支架的制備及復合病毒 將殼聚糖用0.5mol/L乙酸配成2%（w/v）的溶液，將膠原按2%比例溶解于殼聚糖溶液中，磁力攪拌48h后注入培養皿，4℃ 下放置30min，-35℃放置過夜，最后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機凍干，48h后干燥完成。支架在接種細胞或病毒前需滅菌，具體步驟如下：先以0.3M NaOH的溶液中和材料中的乙酸，然后75%乙醇浸泡12h，大量PBS沖洗去除殘余乙醇，紫外線照射30min。
將殼聚糖/膠原支架切塊。在無菌操作臺內，將病毒液滴于支架上，使之浸潤，具體量為：對于G2，G3組，1ml 的腺病毒溶液滴到1mg 的干燥的殼聚糖/膠原支架上，4℃ 過夜使支架與質?；蛳俨《境浞纸Y合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機干燥。對于G4組， Ad-BMP-2與Ad-VEGF病毒液等體積混合后，吸取1ml滴到1mg殼聚糖/膠原支架上，4℃ 過夜使支架與質?；蛳俨《境浞纸Y合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機干燥。對于G5組，將2mg VEGF-D蛋白溶解于2ml的滅菌的去離子水中，獲得的終濃度為濃度為1mg/ml，將2ml溶液滴于干燥的殼聚糖/膠原支架上，再將1ml 的Ad-BMP-2病毒溶液滴到1mg 的干燥的殼聚糖/膠原支架上，所獲得的支架為每1mg 支架有2mg VEGF蛋白及1mlAd-BMP-2病毒液；4℃ 過夜使支架與質粒或腺病毒充分結合，然后-80℃放置2h成型后移入冷凍干燥機干燥（圖1示冷凍干燥機及干燥過程）。
1.3整合不同生長因子的支架對骨髓間充質細胞增殖分化影響的相關研究 MTT 法檢測支架材料對骨髓間充質細胞增殖的影響。將五種支架各選4 塊置于24孔板內，第四代骨髓間充質細胞消化后，以1×105 細胞的密度接種于支架，每個支架100μl細胞懸液。3h后添加 150μl 10%FBS 的DMEM培養液繼續培養，分別在1、3、7d 檢測細胞增殖活性。
ALP檢測：接種方法同前，3 h后添加 900μl 10%FBS 的DMEM 培養液繼續培養，分別在7d和14d 檢測ALP活性。具體方法如下：7和14d后，取上清液，80μl的上清加20μl的0.5M的AMP，然后加入100μl底物，混勻后37°孵育1h。取50μl上清，按堿性磷酸酶試劑盒說明書在405nm波長下測ALP活性。根據換算出的每孔細胞的ALP值和DNA的總量的比值來計算每孔細胞的ALP活性，單位是nmoles paranitrophenol/ng DNA/min。
1.4骨缺損修復的觀察 選取 6 只2歲大的中華田園犬，手術在全麻下進行。局部消毒后，拔除下頜前磨牙，清理牙槽窩后，去除牙槽間隔，以得到骨缺損模型。植入種植體，將支架放入近中牙槽窩，縫合。將G1-G5組每組中的一個樣本隨機置于種植體近中缺損區，以保證每只狗都含有5個組的樣本。術后肌肉注射抗生素（40萬單位/ml，0.1ml/kg體重），動物軟食2w。12w時取材，截取下頜骨種植體周圍缺損區骨，低速渦輪機及去離子水沖洗冷卻下分割標本，進行組織學觀察。
2 結果
2.1 材料制備。
2.2通過MTT法檢測支架材料對骨髓間充質細胞增殖的影響。第四代骨髓間充質細胞三維培養于支架材料中后，分別在1、3、7d檢測，每組每個時間點檢測四個樣品。結果顯示（圖2），復合病毒或/和生長因子蛋白的殼聚糖/膠原支架與殼聚糖/膠原材料對骨髓間充質細胞的增殖沒有影響，病毒或/和生長因子蛋白對骨髓間充質細胞的增殖無毒性作用。
2.3 ALP活性是細胞成骨向分化的標記。骨髓間充質細胞在各組復合支架上三維培養時的ALP活性如圖3所示，7d和14d培養后，培養于復合Ad-BMP-2的支架上的骨髓間充質細胞均表現出較高的ALP活性（P
2.4組織學染色 組織學切片觀察種植體周圍的組織形態，圖4可見，種植體周圍均形生成了成熟的骨組織，骨組織中均有新生成的血管。定性觀察發現，G3與G4組新生成的血管較其他組高，G2，G4及G5組的骨生成多于G1，G3組，以G5組最高。
3 討論
骨缺損修復是復雜的生理過程，一般涉及到細胞遷移、增殖與分化以及骨重建[1]。通常骨形成可通過兩種不同的方式：假如骨斷端是固定的，或者在發育階段顱面部骨形成過程中，在將要形成骨的部位間充質前體細胞直接分化為骨細胞成骨，成為膜內成骨；若發生在有動度骨折斷端間，或者發育過程中的長骨和腰椎，則先形成軟骨稱之為軟骨化骨。新生血管提供營養和氧氣的供應，同時為血液循環中的間充質細胞提供途徑到達缺損區，以及增加骨細胞的增殖分化而起作用，在骨折愈合的初期十分重要 [2]。VEGF是主要的血管生成因子[3]。它在出生后的血管生成起到重要的作用。VEGF對肥厚性軟骨結構和血管化都十分重要。眾多研究發現，VEGF 單獨不能促進成骨[4，5]，已有研究證實VEGF與BMPs聯合使用能促進細胞存活率[6]，誘導成骨細胞增殖與分化[7]，以及促進骨細胞遷移[8]，通過這種方式促進了骨的再生。眾多學者在動物模型中聯合應用VEGF 與BMP-2促進骨再生，總的來說，大多數因子的聯合使用較單獨使用能增加成骨，單獨使用VEGF 不足以促進成骨，聯合使用VEGF能促進骨再生中的血管再生，這與本研究結果一致。有研究指出，在骨折愈合中，血管發生發生在成骨之前[9]。因此，開發一種模擬內源性基因釋放的這種呈時間特異性表達的基因控釋系統對骨組織工程意義十分重大。
由于VEGF在骨再生中有多種作用， VEGF除了促進成骨細胞的存活，它還能誘導血管再生。VEGF刺激內皮的增殖與遷移，并參與祖細胞的招募及分化為內皮細胞[10，11]。高劑量的VEGF已被證實能導致血管通透性的增加，并在骨再生中誘導產生大量的非生理性的內皮細胞管腔[12]。
研究者已經成功復合了殼聚糖/膠原支架。對于復合支架來說，殼聚糖的加入能降低細胞介導的收縮率，即在培養細胞的過程中，復合材料的收縮度比單純膠原支架的收縮率小，材料的機械性能有所增強。細胞在復合支架中更容易黏附，生長并增殖。分析是因為膠原成分的加入在四個方面提高了材料的細胞相容性：其一，降低了復合材料的孔徑，增大了材料的細胞容積；其二，增大了復合材料的吸水性，使細胞在支架中更容易交換營養與代謝物；其三，膠原本身可作為細胞營養的來源；其四，降低了材料的降解性能，使細胞更容易滲透到支架內部生長繼而引發進一步的支架降解?？偟膩碚f，本實驗制備了一種基因控釋支架，通過冷凍干燥法使生長因子與腺病毒結合，腺病毒介導的外源性基因能高效表達，在缺損區局部釋放，避免了腺病毒導致的免疫反應，在骨再生中具有潛在的應用前景。
參考文獻：
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[3]Peng H， Wright V， Usas A， et al. Synergistic enhancement of bone formation and healing by stem cell-expressed VEGF and bone morphogenetic protein-4[J]. J Clin Invest，2002，110：751-759.
[4]Peng H， Usas A， Olshanski A， et al. VEGF improves， whereas sFlt1 inhibits， BMP2-induced bone formation and bone healing through modulation of angiogenesis[J]. J Bone Miner Res， 2005，20（11）：2017-2027.
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[7]Wang， D.S.， Miura， M.， Demura， H. & Sato， K. Anabolic effects of 1，25-dihydroxyvitamin d3 on osteoblasts are enhanced by vascular endothelial growth factor produced by osteoblasts and by growth factors produced by endothelial cells[J]. Endocrinology，1997，138： 2953-2962.
[8]Mayr-Wohlfart U， Waltenberger J， Hausser H， et al. Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts[J]. Bone，2002，30：472-477.
[9]Sojo K， Sawaki Y， Hattori H， et al. Immunohistochemical study of vascular endothelial growth factor （VEGF） and bone morphogenetic protein-2， -4 （BMP-2， -4） on lengthened rat femurs[J]. J Craniomaxillofac Surg，2005，33：238-245.
玩具簡介：
“舀豆子”是一個投放在小班生活區的低結構玩具。
材料投放：兩個大容器、大小不同的勺子、彈珠。
玩具的玩法：讓孩子學會使用勺子，從裝有彈珠的容器中將彈珠一個個舀到另一個空容器中，鼓勵幼兒盡量把彈珠全部轉移干凈，并且保證彈珠不滾落出容器和勺子外。
一、基于觀察的第一次材料投放
（一）觀察案例
案例一：暢暢彩棒圈珠子
最近兩次活動中，暢暢都游蕩在各個區域間，看看這個，瞧瞧那個，就是不愿意進去玩，盡管老師引導了，她還是一個勁搖頭，最終在好朋友的邀請下，選擇生活區“舀珠子”的工作。她拿起勺子在小碗里將珠子從這個碗舀到旁邊的空的小碗里，沒過多一會兒，她就開始東張西望，已經對舀珠子的游戲沒有了興趣?？匆娕赃叺溺麋髡谶M行小彩棒搭建的活動，暢暢忽然興奮起來，她拿起小勺子，舀起碗里的彈珠，放到琪琪用小彩棒搭的格子里，咕嚕咕嚕彈珠滾到了地上。怎樣才能讓珠子固定不滾動？在反復嘗試了多次，最終，她們用小彩棒搭了完整四邊形珠子被圈住了。當時，誰也沒有想到好辦法，但這也為接下來的游戲埋下了有趣的伏筆，為彈珠找家成為了“熱門話題”。
案例二：欣欣送珠子回家
這天，我好奇看著欣欣在低著頭，弓著腰，小心翼翼在不停擺弄著，并隨著小珠子的滾動，還發出“哎呀哎呀”的嘆息聲，只見她拿起勺子看看，好像在琢磨著什么，又在放勺子的盤里，看看這個勺子，看看那個勺子，終于選好自己想用的勺，即：欣欣一個勺把短并且凹面深的勺子。再次拿起心儀的勺子，欣欣一次就將彈珠放進瓶蓋了，她激動地從小椅子上跳了起來，喊道：“我送珠珠回到了家了”！原來欣欣一直在做珠子和瓶蓋顏色對應的游戲。
（二）案例解讀
關鍵詞：東張西望、彩棒、短且凹面深
1.東張西望：舀珠子雖然是一個低結構的材料，但是，由于教師提供的材料品種的單一，如：僅提供彈珠作為舀的材料，孩子對機械、重復、單一的活動已經不感興趣，東張西望。真正吸引孩子的是有趣、多變開放性操作的材料，要給孩子提供更多嘗試、創作、想象的空間。
2.彩棒：暢暢選擇小棒表明在孩子與玩具互動中，能夠自己自發選擇材料，對游戲有濃厚的興趣，有創新游戲的能力，同時也迫切需要教師多種材料的支持其深入的探究。
3.欣欣能夠根據自己的能力認知，對教師提供的多種材料，加以調適和選擇。教師可以根據幼兒的能力投放材料，也可以適度增加超出或降低其能力的材料投放，這樣符合《指南》中60%孩子能達到設定目標，而另外超出能力的20%或低于能力20%的孩子，我們應提供更多材料供孩子選擇。
如何在原有的基礎上持續吸引幼兒的學習興趣，又能對幼兒的能力有一定的促進，這讓我更關注孩子們游戲中的變化。
（三）材料支持策略：關注幼兒興趣、支持他們自主游戲。
關鍵詞：兩個維度 舀的工具、舀的內容
第一維度：舀的工具 進一步豐富舀的工具，首先可以從勺的變化中給予支持，如勺把長短變化、勺面深淺變化、勺材質的變化。讓孩子通過實踐操作感受舀的工具多種變化，激發幼兒探索新的玩法吸引幼兒的興趣。
第二維度：舀的內容 提供多種材料進一步煉幼兒手眼協調能力及手部的控制力，提供大小、形狀各異的顆粒物，如珠子、豆子、鈴鐺。也可以提供粉末狀如面粉、包谷糝舀出容易兩個面，還可以提供多種材料：泡沫塊、小鐵塊等。進一步練習幼兒的精細動作，增加游戲的難度。
二、基于觀察的第二次材料投放
（一） 觀察案例：
案例一：孫嘉逸在玩舀水工作
在舀水的工作，孫嘉逸拿了一個瓶子、拿起大勺子滿滿舀了一勺水，低著頭身體慢慢移動著，小心翼翼地往漏斗里到，但總是把水灑在桌上、地上，試過幾次后，水還是灑在桌上，他環視著周圍，試圖在尋找著什么，耷拉著腦袋撅著小嘴 ，他想放棄游戲。
案例二： 晨晨在玩舀水工作：
晨晨先拿了一個瓶子，大口深的勺子，舀起滿滿一勺水，也出現了的問題，水灑的到處都是，咦！怎么回事，只見他拿起小勺子，三指捏住，又看看自己一把抓拿著大勺子，噢明白了，晨晨臉上露出微微的笑容。大勺子也用三指捏辦法，這樣試試好多了，反復練習幾次后他成功了。不過這次在舀的材料和形式都有了新的變化，水桶里多了一些大小形狀不同的積木、雪花片、乒乓球，這些玩具漂浮在水面上，不僅增添游戲的難度，也使操作活動更有趣味性。晨晨選用小勺子，很自如把漂浮物都舀了出來，臉上露出了成功的喜悅。
（二）案例解讀
關鍵詞：三指捏、平移提升、少量多添、豐富材料
1三指捏：晨晨從開始一把抓的拿勺方式，到通過自我調整，自己借鑒已有的經驗和技能，調適為三指捏勺的方式，最終獲得游戲的成功。
2.平移提升：舀液體對孩子有了更高的要求。勺子舀水后先慢慢平移到瓶底處，再自然向上提升到瓶口處，最后傾斜勺子倒水。這一系列的動作對孩子手部協調性及控制能力有了較高的要求。
3.少量多添：案例中幼兒舀滿滿的一勺水，出現了水灑在桌上、地上，通過控制舀水的量進行自我調適，采用少量多添的辦法操作，達成了通過主動操作提高幼兒動手能力和手眼協調能力的學習目的。
4.豐富材料：孫嘉逸放棄游戲，反映出可供幼兒選擇的材料不足。先提供寬口瓶、大口深的勺子，降低了游戲的難度。待舀的技能有了一定基礎后，再選擇窄口瓶進行嘗試。晨晨通過自我調適動作完成游戲，選擇舀水里的漂浮物，用新的材料進一步練習手眼的協調能力及手部的控制力。在同一年齡段投放不同難度的材料，這樣既滿足幼兒的一般發展需要，又滿足了個別幼兒特殊發展需要，讓缺乏自信的幼兒看到成功，讓已成功的幼兒不斷看到新的方向。
（三 ）材料支持策略：關注幼兒能力，適時調整材料投放
關鍵詞：兩個維度舀出容器、舀入容器
第一維度：舀出容器的變化 借鑒烏鴉喝水的故事，我思考從舀出容器本身的變化，增添游戲的難度 。如：原來盛物的容器小桶幼兒容易操作，為不斷滿足幼兒探索的欲望，改變舀出容器，提供窄口且深瓶子，幼兒在操作中不斷嘗試探索舀的方式。這樣不僅增添游戲的難度，也使操作活動更有趣味性。
第二維度：舀入容器的變化 增加材料難度。如：將舀出的水倒在礦泉水的瓶蓋上，增加游戲難度，進一步鍛煉幼兒手眼協調能力和腕部的小肌肉的控制力。如：舀的是面粉，對幼兒有了更高的要求，倒入啤酒瓶時，不僅要控制好倒的速度，還要控制好勺子傾斜的角度。
三、基于^察的第三次材料投放
（一）觀察案例
案例：運水游戲
我們將舀水的游戲活動，從室內轉移到室外，從個人獨立游戲演變成小組合作的運水游戲，游戲要求小組合作把大盆里的水運到對面的盆里，比一比哪組運的又快又好。
比賽開始，孩子們都用小碗、小杯、瓶子運水。石沐欣用小桶舀水后發現大盆里的水一下少了很多，她像發現新大陸似地說：“凱凱，快！你也去拿小碗舀水，晨晨我們一起抬起來?！毙佬浪麄兡脕砹诵∨?、用口杯、小碗往小桶里舀水……在大家齊心協力下，水很快就剩一點了，再怎么辦呢？容容拿來了漏斗，把漏斗套在礦泉水瓶里，用勺子往瓶子里舀水。石沐欣著急地說：“這樣太慢了，我們把大盆抬起來把水倒在瓶子里。幾個孩子抬起大盆，“不好水灑在外面這樣不行，還是用勺子舀吧”凱凱著急的大聲喊道。……比賽結束了，石沐欣這組獲得了第一名，孩子們高興得跳起來。
（二）案例解讀：
1.目標能夠引導合作
小班幼兒以獨立操作游戲為主，幼兒的交流合作較少。教師在設計“運水”游戲時，提供了各種能舀水材料，游戲的目標用不同的材料鍛煉幼兒舀液體能力。以比一比哪組運的又快又好為游戲規則，激發幼兒合作的愿望，讓幼兒嘗試合作帶來的樂趣。
2.材料能夠促進合作
在玩“運水”的游戲中，提供了大小不一的舀水用具、一大盆水怎樣又快又好的運完，簡單的問題復雜化，增加了活動的難度，幼兒不能獨立完成任務，迫使他們合作共同完成，在其中幼兒間多了一些分工、協商、配合的機會，使合作成了一種需要、一種必然，從而激發幼兒合作的欲望。
（三）材料支持策略：關注同伴間的材料，培養合作意識
關鍵詞：兩個維度 水量的變化、多元化的材料支持
